一种检测汞离子的目视比色传感器制造技术

本发明专利技术提供一种检测汞离子的目视比色传感器，设计具有特殊发夹结构的H‑DNA，在汞离子存在下，H‑DNA的3’端和5’端通过T−Hg

【技术实现步骤摘要】
一种检测汞离子的目视比色传感器
本专利技术涉及一种基于核酸外切酶III辅助目标循环利用和DNA催化酶共同放大信号的目视比色传感器检测汞离子的方法，属于分析化学领域。
技术介绍
汞及汞化合物的分布非常广泛，是对人类和人类所生存环境危害最大的有毒重金属之一。由于工业上利用汞的毒理性将其应用于防腐剂、农药、抗菌剂等工业产品中，使得人们接触汞及汞化合物的概率大大增加。汞离子即使在浓度很低也会对人的身体健康造成巨大威胁。随着人们生活水平和健康意识的提高，越来越多的人开始关注汞对人体健康的危害。有研究表明，汞是有可能会导致人的运动机能和记忆能力变差的重金属元素，吸入过量的汞有可能会导致人的肾脏系统、神经系统、免疫系统、生殖系统等受损；此外，汞及汞化合物可以通过如空气、水、食物等多种途径进入人体，而且汞具有生物富集性，进入人体的汞也很难排出，因此对人体危害很大。随着现代分析测试技术的快速发展，越来越多的汞离子检测方法问世，目前常用的汞离子分析测试方法主要是仪器分析法，如电感耦合等离子体原子发射光谱法（ICP-AES）、电感耦合等离子体质谱法、原子吸收光谱法（AAS）、冷蒸气原子荧光光谱法(CV-AFS)等。这些传统检测法由于操作复杂、样品检测环境要求高、仪器昂贵和无法实地检测等原因，使得它们的应用受到了限制。随着现代分析测试技术的快速发展，越来越多的新方法被应用到汞的分析检测中，例如电化学方法、荧光方法和比色检测法等方法已经广泛应用于汞离子的检测。比色法由于其结果明显、简单、快速和灵敏度高等特点受到广泛关注。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种检测汞离子的目视比色传感器，这种比色传感器检测方法利用核酸外切酶III辅助目标循环和DNA催化酶共同放大信号的策略大大提高检测的灵敏度。设计一种发夹结构的H-DNA，在汞离子存在时,其茎干部分会互补配对，引发核酸外切酶III对其进行剪切，生成的富含鸟嘌呤的单链DNA，在氯化血红素存在时可以形成DNA催化酶，催化3,3',5,5'-四甲基联苯胺（TMB）与H2O2的反应，生成蓝色物质，通过观察溶液颜色的明显变化来判断目标分析物汞离子是否存在，以及含量的多少，可以解决传统分析检测方法检测汞离子的操作复杂、要求高、检测成本高和背景干扰大等问题。本专利技术的检测方法操作简单、成本低，时间短，能够快速地可视化检测环境水样中的汞离子含量。为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：一种基于核酸外切酶III和DNA催化酶放大信号的目视比色传感器，由发夹结构的H-DNA、氯化血红素、核酸外切酶III、3,3',5,5'-四甲基联苯胺与H2O2组成。所述H-DNA的序列为：5’-CTTTAGGGTGGGGAGGGTGGGGCCCCACCCTTTTG-3’。所述发夹结构H-DNA的制备方法是：将H-DNA溶于含有100mMNaCl和5mMMgCl2的20mMpH7.4Tris-HCl缓冲液1中，在90℃条件下加热10分钟，自然冷却到室温。所述发夹结构H-DNA的浓度为2.5μM。所述的氯化血红素的浓度为7.75μM，配制方法为：将氯化血红素样品溶于二甲亚砜，然后用Tris-HCl缓冲液2稀释到所需浓度；Tris-HCl缓冲液2含300mMTris-HCl、10mMTCEP、1MNaCl、1mMEDTA和1mMMgCl2，pH7.4。所述的核酸外切酶III的浓度为2.5U/μL。所述3,3',5,5'-四甲基联苯胺的浓度为5.0mM，H2O2的浓度为10.0mM；所述3,3',5,5'-四甲基联苯胺的配制方法为：先将3,3',5,5'-四甲基联苯胺样品溶于纯乙醇中，然后加超纯水定容，用由10mMNaH2PO4和10mMNa2HPO4组成的pH5.5PBS缓冲液稀释到所需浓度。所述的H2O2的配制方法是用超纯水稀释30%过氧化氢到所需浓度。一种基于核酸外切酶III辅助目标循环利用和DNA催化酶共同放大信号的目视比色传感器检测汞离子的方法，按照以下步骤进行：（1）分别取45μL浓度为2.5μM的H-DNA和45μL不同浓度的Hg2+标准液，混合均匀，2min后向其中加入10μL浓度为2.5U/μL的核酸外切酶III(Exo-III)，混匀后放入K30经济型干式恒温器中，在35℃条件下反应40min;（2）待上述的反应溶液冷却之后，向其中加入100μL浓度为7.75μM的氯化血红素（hemin），混匀后放入冰箱（4℃）反应30min;（3）向上述的反应体系分别加入100μL浓度为5.0mM的3,3',5,5'-四甲基联苯胺（TMB）和100μL浓度为10.0mM的H2O2，混匀混合1min后观察溶液颜色变化。步骤（1）中的H-DNA溶液的缓冲液是Tris-HCl缓冲液1(TB1)，由20mMTris-HCl,100mMNaCl和5mMMgCl2（pH7.4）组成，将H-DNA溶于TB1中，在90℃条件下加热10分钟，然后自然冷却到室温。步骤（2）中的氯化血红素（hemin）的稀释缓冲液是由300mMTris-HCl,10mMTCEP，1MNaCl,1mMEDTA和1mMMgCl2组成的Tris-HCl缓冲液2（pH7.4）（TB2），先将氯化血红素溶于二甲亚砜（DMSO）中，然后用TB2稀释到所需要的浓度。步骤（3）中的3,3',5,5'-四甲基联苯胺（TMB）的稀释缓冲液是由10mMNaH2PO4和10mMNa2HPO4组成的PBS缓冲液（pH5.5），先将TMB样品溶于纯乙醇中，然后加超纯水定容，用PBS缓冲液（pH5.5）稀释到所需浓度。所述Hg2+标准液的配制方法是将Hg2+标准液储备液用质量分数为0.5%的HNO3稀释到所需要的浓度。实际样品处理是：将环境水样品静置一段时间后，用0.22μm的微孔滤膜过滤，往过滤液中加稀硝酸，使溶液中HNO3的最终浓度为0.5%，混合均匀。本专利技术的显著优点：（1）构建了一种基于核酸外切酶III辅助目标循环利用和DNA催化酶共同放大信号的无标记、超灵敏的汞离子目视比色传感器。在汞离子存在时，H-DNA的茎干部分完全互补，引发核酸外切酶III对其剪切，生成富含鸟嘌呤（G）的DNA单链，在氯化血红素（hemin）存在时，会形成DNA催化酶,可以催化3,3',5,5'-四甲基联苯胺（TMB）与H2O2的反应，生成蓝色产物。汞离子浓度不同，溶液颜色的深浅度不同，通过肉眼即可以半定量检测汞离子而不需要借助仪器检测，因此操作简便、成本低；（2）本专利技术所使用的H-DNA不需要进行修饰和信号标记即可检测汞离子；（3）本专利技术所使用的3,3',5,5'-四甲基联苯胺（TMB）是一种性质稳定、无毒无害的物质，比较安全，因此本专利技术的目视比色传感器是环境友好型的；（4）本专利技术的目视比色传感器检测汞离子的最低检出浓度低至2.0fM,检测范围为2.0fM-50nM；(5)本专利技术的汞离子目视比色传感器特异性好，反应温和，检测速度快，重现性好，操作简便，可以快速可视化检测汞离子。附图说明图1目视比色传感器检测汞离子的原理图，在汞离子存在的条件下，H-DNA的3’端和5’端的通过T−Hg2+−T结构互补配对，使得H-DNA的茎干部分完全互补，引发核酸外切酶III对其剪切，生成富含鸟嘌呤的DNA本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于核酸外切酶III和DNA催化酶放大信号的目视比色传感器，其特征在于：所述传感器由发夹结构的H‑DNA、氯化血红素、核酸外切酶III、3,3',5,5'‑四甲基联苯胺与H2O2组成。

【技术特征摘要】
1.一种基于核酸外切酶III和DNA催化酶放大信号的目视比色传感器，其特征在于：所述传感器由发夹结构的H-DNA、氯化血红素、核酸外切酶III、3,3',5,5'-四甲基联苯胺与H2O2组成。2.根据权利要求1所述的一种基于核酸外切酶III和DNA催化酶放大信号的目视比色传感器，其特征在于：所述H-DNA的序列为：5’-CTTTAGGGTGGGGAGGGTGGGGCCCCACCCTTTTG-3’。3.根据权利要求1所述的一种基于核酸外切酶III和DNA催化酶放大信号的目视比色传感器，其特征在于：所述发夹结构H-DNA的制备方法是：将H-DNA溶于含有100mMNaCl和5mMMgCl2的20mMpH7.4Tris-HCl缓冲液1中，在90℃条件下加热10分钟，自然冷却到室温。4.根据权利要求3所述的一种基于核酸外切酶III和DNA催化酶放大信号的目视比色传感器，其特征在于：所述发夹结构H-DNA的浓度为2.5μM。5.根据权利要求1所述的一种基于核酸外切酶III和DNA催化酶放大信号的目视比色传感器，其特征在于：所述的氯化血红素的浓度为7.75μM，配制方法为：将氯化血红素样品溶于二甲亚砜，然后用Tris-HCl缓冲液2稀释到所需浓度；Tris-HCl缓冲液2含300mMTris-HCl、10mMTCEP、1MNaCl、1mMEDTA和1mMMgCl2，pH7.4。6.根据权利要求1所述的一种基于核酸外切酶III和DNA催化酶放大信号的目视比色传感器，其特征在于：所述的核酸外切酶III的浓度为2.5U/μL。7.根据权利要求1所述的一...

【专利技术属性】
技术研发人员：许雪琴，洪敏强，李明玉，曾碧花，
申请(专利权)人：福州大学，
类型：发明
国别省市：福建,35