一种利用SERS光谱表征毒素对活细胞损伤作用的方法技术

本发明专利技术提供了一种利用SERS光谱表征毒素对活细胞损伤作用的方法，将SERS光谱应用到活细胞表征中，不但拓展了SERS光谱的新应用，也对活性细胞损伤的研究具有潜在的应用前景。以TAT功能化SERS探针作为拉曼增强基底，通过受体依赖介导的胞吞作用跨膜进入活性细胞，增强了细胞本身的拉曼信号。通过检测毒素作用前后细胞的平均SERS光谱的变化来实现对细胞损伤的表征，并利用差谱分析和PCA对比了毒素作用不同时间的细胞的差异，识别和区分了不同状态下的细胞。为了进一步验证细胞的凋亡水平，运用AnnexinV‑FITC/PI双染试剂利用流式细胞术对细胞凋亡情况进行量化。本发明专利技术能够实时无损监测毒素对细胞的损伤作用，具有简单易行、便捷高效的优点。

【技术实现步骤摘要】
一种利用SERS光谱表征毒素对活细胞损伤作用的方法
本专利技术涉及纳米材料和生命科学领域，具体涉及一种利用SERS光谱表征毒素对活细胞损伤作用的方法。
技术介绍
相思子毒素(Abrin)是从豆科植物种子中分离的一种细胞毒性蛋白，其毒性超过了蓖麻毒素，小鼠的LD50为0.05μg/kg，成年人的致死剂量为5.0～7.0μg/kg，已被列入一种潜在的重要生物毒素战剂和生物恐怖病原物质之一。相思子毒素结构、作用机理与蓖麻毒素类似，均由A、B两条链组成，由一个二硫键相连，B链具有半乳糖凝集活性，可与细胞膜上受体结合，帮助A链进入细胞内，A链进入细胞催化60S大亚基的28SrRNA的第4324位脱去腺嘌呤而使60S核糖体亚基失活，从而使细胞蛋白合成被抑制。相思子毒素没有特异的化学基团和元素，一般的物理、化学和生化方法很难给予鉴别，中毒早期无特殊中毒症状和病变，待发现中毒症状后，已难以治疗，侦检极为困难。对这类毒素的检测只能依赖于抗原-抗体特异反应的免疫学检测方法。中毒早期相思子毒素就会对细胞有一定程度的损伤从而诱导细胞的凋亡，而从细胞凋亡到细胞坏死的每个凋亡阶段细胞内发生变化的物质和程度都不一样，但仅通过普通的试剂盒无法判断细胞受损程度和凋亡水平。因此迫切需要方便、灵敏的检测细胞凋亡水平的方法，使能及时发现中毒早期，及时给予治疗，降低死亡率。1928年，印度物理学家Raman第一次发现了拉曼散射现象。由于拉曼位移仅与物质分子的振动和转动能级有关，因此拉曼光谱技术可用于进行分子结构定性分析。1974年，Fleischmann等人发现在粗糙的银表面吸附单层吡啶分子，受到电磁波和化学增强机制的影响，拉曼信号强度大幅度地增强。之后通过其他科学家系统的实验和计算，指出具有粗糙的表面和纳米级表层的贵金属能够增加分析物的拉曼散射信号，并且产生的增强因子是正常拉曼散射的104-108倍。这种现象被称为表面增强拉曼现象。随着表面增强拉曼光谱(SurfaceEnhancedRamanScattering,SERS)技术的快速发展，逐渐成为了一种强大的分析检测工具，在生物科学、表面科学以及分析科学方面被广泛应用。SERS光谱是一种无损光谱技术。它能够进行指纹识别，并且能从分子水平出发，对物质的结构及组成信息进行探究。与其他光谱手段相比，它还不易受水的影响、光谱带宽相对较窄、不易淬灭、可用红光引发，因此非常适合于生物体系，特别是对于单个活细胞的研究。SERS光谱作为一种指纹图谱，可以实现实时监测毒素作用细胞的损伤过程。本专利技术提供了一种利用SERS光谱表征毒素对活细胞损伤作用的方法，将SERS光谱应用到活细胞表征中，不但拓展了SERS光谱的新应用，也对活性细胞损伤的研究具有潜在的应用前景。以TAT功能化SERS探针作为拉曼增强基底，通过受体依赖介导的胞吞作用跨膜进入活性细胞，增强了细胞本身的拉曼信号。通过检测毒素作用前后细胞的平均SERS光谱的变化来实现对细胞损伤的表征，并利用差谱分析和PCA对比了毒素作用不同时间的细胞的差异，识别和区分了不同状态下的细胞。为了进一步验证细胞的凋亡水平，运用AnnexinV-FITC/PI双染试剂利用流式细胞术对细胞凋亡情况进行量化。本专利技术能够实时无损监测毒素对细胞的损伤作用，具有简单易行、便捷高效的优点。
技术实现思路
：本专利技术的目的在于利用SERS光谱指纹识别的特性对毒素作用活细胞产生的损伤作用进行快速、准确的实时监测，特别涉及到纳米材料应用于生命科学的检测。为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：1.前述的一种利用SERS光谱表征毒素对细胞损伤作用的方法中，所述的TAT功能化SERS探针由金纳米星(AuNSs)偶联穿膜肽(TAT)制得。2.前述的一种利用SERS光谱表征毒素对细胞损伤作用的方法中，所述的显微共聚焦拉曼光谱仪的设定参数是：二极管激发波长是633nm，曝光时间为10s，循环次数为1次。3.前述的一种利用SERS光谱表征毒素对细胞损伤作用的方法中，所述的毒素是相思子毒素。4.前述的一种利用SERS光谱表征毒素对细胞损伤作用的方法中，所述的活性细胞是人的肝癌细胞HepG2。5.前述的一种利用SERS光谱表征毒素对细胞损伤作用的方法中，所述的利用SERS光谱表征毒素对细胞损伤作用的方法：是用探针与细胞孵化使探针进入细胞内，期间加入相思子毒素，然后进行拉曼多光谱检测。6.前述的一种利用SERS光谱表征毒素对细胞损伤作用的方法中，所述的AnnexinV-FITC/PI双染试剂利用流式细胞术对细胞凋亡情况进行量化。本专利技术的优点是：(1)TAT功能化SERS探针的制备简单便捷。(2)将SERS光谱应用到活细胞的表征中，拓展了SERS光谱的新应用，同时对活性细胞损伤的研究具有潜在的应用前景。(3)本实验简单易行、便捷高效，结果准确可靠，为实时监测毒素对细胞的损伤作用提供了新方法。附图说明图1：金种子的紫外-可见吸收光谱图(A)和TEM电镜图(B)；图2：金纳米星的紫外-可见吸收光谱图(A)和TEM电镜图(B)；图3：不同激发波长下NBA标记金纳米星的SERS光谱(A)和在633nm激发光条件下，592cm-1处NBA的SERS强度(B)；图4：TAT修饰后的金纳米星的紫外-可见吸收光谱图(A)和TAT修饰后的金纳米星的SERS光谱(B)；图5：水溶液中TAT功能化SERS探针37℃下放置不同时间的紫外-可见吸收光谱(A)和培养基中TAT功能化SERS探针37℃下放置不同时间的紫外-可见吸收光谱((B)；图6：不同浓度金含量(0、25、50、100、200和500μM)的TAT功能化SERS探针与HepG2细胞共培养24h的存活率(A)、200μM金含量的功能化SERS探针与HepG2细胞共培养不同时间(12、24、36、48和72h)的细胞存活率(B)；图7：不同浓度的相思子毒素(0、1.2、6、12、60和600μg/mL)侵染HepG2细胞12h的细胞存活率；图8：60μg/mL的相思子毒素侵染HepG2细胞不同时间(0、2、4、8、12和24h)的平均拉曼光谱；图9：60μg/mL的相思子毒素侵染HepG2细胞不同时间(0、2、4、8、12和24h)之间的差谱分析；图10：相思子毒素作用肝癌细胞HepG2不同时间的PCA散点图；图11：用膜联蛋白V-FITC/PI染色流式细胞术测定60μg/mL的相思子毒素侵染HepG2细胞不同时间(0、2、4、8、12和24h)的细胞凋亡水平。具体实施方式本专利技术包括但不限于以上实施例，凡是在本专利技术的精神和原则下进行的任何等同替换或者局部改进，都将视为在本专利技术的保护范围之内。实施例1金种子的合成路线如下：称取0.2g柠檬酸三钠溶于20mL的超纯水中配成质量分数为1％的柠檬酸三钠水溶液。将1mL浓度为100mM的HAuCl4加入99mL沸腾的超纯水中。然后加入15mL质量分数为1％的柠檬酸三钠水溶液并剧烈搅拌。反应10分钟后，金溶胶的颜色变成酒红色，终止反应。制备的金种子常温冷却至室温，用紫外-可见吸收光谱图(图1A)和TEM电镜图(图1B)进行表征，在4℃下储存备用。实施例2金纳米星的合成路线如下：将50μL浓度为100mM的HAuCl4溶液加入19.5本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种利用SERS光谱表征毒素对活细胞损伤作用的方法，其特征在于：SERS是一种高灵敏度探测活细胞内生化成分的有效成分，将SERS光谱应用到活细胞表征中，不但拓展了SERS光谱的新应用，也对活性细胞损伤的研究具有潜在的应用前景。以TAT功能化SERS探针作为拉曼增强基底，通过受体依赖介导的胞吞作用跨膜进入活性细胞，增强了细胞本身的拉曼信号。通过检测毒素作用前后细胞的平均SERS光谱的变化来实现对细胞损伤的表征，并利用差谱分析和PCA对比了毒素作用不同时间的细胞的差异，识别和区分了不同状态下的细胞。为了进一步验证细胞的凋亡水平，运用AnnexinV‑FITC/PI双染试剂利用流式细胞术对细胞凋亡情况进行量化。

【技术特征摘要】
1.一种利用SERS光谱表征毒素对活细胞损伤作用的方法，其特征在于：SERS是一种高灵敏度探测活细胞内生化成分的有效成分，将SERS光谱应用到活细胞表征中，不但拓展了SERS光谱的新应用，也对活性细胞损伤的研究具有潜在的应用前景。以TAT功能化SERS探针作为拉曼增强基底，通过受体依赖介导的胞吞作用跨膜进入活性细胞，增强了细胞本身的拉曼信号。通过检测毒素作用前后细胞的平均SERS光谱的变化来实现对细胞损伤的表征，并利用差谱分析和PCA对比了毒素作用不同时间的细胞的差异，识别和区分了不同状态下的细胞。为了进一步验证细胞的凋亡水平，运用AnnexinV-FITC/PI双染试剂利用流式细胞术对细胞凋亡情况进行量化。2.如权利要求1所述的一种利用SERS光谱表征毒素对细胞损伤作用的方法，其特征在于：所述的TAT功能化SERS探针是由金纳米星(AuNSs)偶联穿膜肽(TAT)制得；按下述路线合成：1)制备金种子：称取0.2g柠檬酸三钠溶于20mL的超纯水中配成质量分数为1％的柠檬酸三钠水溶液。将1mL浓度为100mM的HAuCl4加入99mL沸腾的超纯水中。然后加入15mL质量分数为1％的柠檬酸三钠水溶液并剧烈搅拌。反应10分钟后，金溶胶的颜色变成酒红色，终止反应。制备的金种子常温冷却至室温，在4℃下储存备用。2)制备AuNSs：将50μL浓度为100mM的HAuCl4溶液加入19.5mL不断搅拌的超纯水中，然后分别加入200μL上述制得的金种子、200μL浓度为3mM的硝酸银溶液和100μL浓度为100mM的抗坏血酸溶液，在室温下搅拌反应10min至溶液颜色变为蓝绿色。最后通过3000rpm离心15min终止反应。3)制备TAT功能化SERS探针：在上述制备的金纳米星溶液中加入100μLSH-PEG-COOH(10μM)溶液并且不断搅拌1h后以3000rpm的转速离心15min去除多余未反应的试剂，加入PBS重悬。然后将20μLTAT加入到上述溶液中，37℃振荡过夜孵育。最后以3000rpm的转速离心两次，每次15min，用超纯水重悬，即制得TAT功能化SERS探针。3.如权利要求1所述的一种利用SERS光谱表征毒素对细胞损伤作用的方法，其特征在于：所述的显微共聚焦拉曼光谱仪的设定参数是：二极管...

【专利技术属性】
技术研发人员：马小媛，张京娜，王周平，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32