猪流行性腹泻病毒疫苗毒与野毒株鉴别引物及其制备方法技术

一种猪流行性腹泻病毒疫苗毒与野毒株鉴别引物及其制备方法，属于猪流行性腹泻病毒的检测技术领域具体设计PEDV疫苗毒CV777与野毒株，其差异基因序列为：GTCTTCCTGTGGCACCTGAAACAA。对应引物如包括Ps1，其序列为：ACACTATACTATCCCACCG；Pa1，其序列为：TTTCAGGAGCTACATTARG；Pa2，其序列为：CACCCAAAGATCCCAAGA；其中Ps1/Pa1引物对扩增片段长度为505bp；Ps1/Pa2引物对扩增片段长度为793bp；本发明专利技术的制备方法包括步骤：RNA的提取、PEDV疫苗株与野毒株RT‑PCR鉴别、特异性试验、敏感性试验、检测结果。

【技术实现步骤摘要】
猪流行性腹泻病毒疫苗毒与野毒株鉴别引物及其制备方法
本专利技术属于猪流行性腹泻病毒的检测
，具体是猪流行性腹泻病毒疫苗毒与野毒株鉴别引物及其制备方法。
技术介绍
猪流行性腹泻病是由猪流行性腹泻病毒引起的猪的一种急性肠道传染病，以水泻、呕吐和脱水为特征。其病原属于冠状病毒科冠状毒病属。猪流行性腹泻病毒可在猪群中持续存在，各种年龄的猪都易感，尤其是哺乳仔猪，极易感染，发病率可达100％。7日龄以内的乳猪病死率高达100％，给养猪业造成了极大的经济损失。目前PEDV感染普遍，流行范围广，而预防该病的弱毒疫苗也使用较为广泛，仅靠抗体检测不能真实的反应猪群的免疫状态，因此对PEDV进行疫苗株与野毒株的鉴别诊断对于该病的免疫与预防具有重要意义。
技术实现思路
本研究所要解决的技术问题是，根据猪流行性腹泻病毒疫苗株CV777，野生毒株等基因组序列比对，发现在猪流行性腹泻病毒基因组2902-3696之间，野生毒株存在一段长约24bp的碱基序列，疫苗株不存在该序列。我们以这段差异序列为基础，针对PEDV基因的保守序列以及疫苗株与野毒株的差异设计引物，建立了RT-PCR鉴别方法，并初步将此检测方法应用于临床样品检测，具有良好的鉴别效果。本研究针对的病毒为PEDV疫苗毒CV777与野毒株，其差异基因序列为：GTCTTCCTGTGGCACCTGAAACAA。所述引物如下。Ps1，其序列为：ACACTATACTATCCCACCG。Pa1，其序列为：TTTCAGGAGCTACATTARG。Pa2，其序列为：CACCCAAAGATCCCAAGA。其中Ps1/Pa1引物对扩增片段长度为505bp。Ps1/Pa2引物对扩增片段长度为793bp。一种猪流行性腹泻病毒疫苗毒与野毒株鉴别引物及其制备方法，该方法包括一下步骤：RNA的提取：本实验方法参照TaKaRaMiNiBESTViralRNA/DNAExtractionKitVer.5.0试剂说明书进行。PEDV疫苗株与野毒株RT-PCR鉴别：取200μLEP管，建立50μL的一步法RT-PCR反应体系，其中PrimeScript1StepEnzymeMix需要2μL、2×1StepBuffer需要25μＬ、RNA模板需要8μL、Ps1、Pa1和Pa2引物2.5pmol-10pmol，、RNasefreedH2O需要11μL，混匀后离心；所述一步法RT-PCR反应条件设定为50℃45min；94℃2min；94℃30s，50℃-60℃30s，72℃1min，35个循环；72℃15min；10℃停止；取7μLPCR扩增产物于1.2％的琼脂糖凝胶进行电泳，观察扩增结果，并回收目的条带进行序列测定。结果表明经RT-PCR一步法扩增，电泳结果显示PEDV疫苗株与野毒株病毒均可扩增出793bp的基因片段，只有野毒株才能扩增出505bp的基因片段而疫苗株不能扩增出505bp的基因片段，表明该引物能够鉴定PEDV，并能鉴别PEDV疫苗株与野毒株病毒。将获得目的片段进行序列比较，证实目的片段是PEDV基因片段。确定Ps1、Pa1引物各5pmol、Pa2引物10pmol，退火温度在55℃时为最佳扩增条件，可分别获得PEDV505bp、793bp的与预期大小相符的目的片段。特异性试验：用上述PEDV疫苗株与野毒株鉴别方法检测猪肠道RNA病毒，即猪传染性胃肠炎病毒、猪轮状病毒、猪札幌病毒和猪嵴病毒，验证引物特异性。结果表明只有PEDV病毒可以扩增出相应的条带，而猪传染性胃肠炎病毒、猪轮状病毒、猪札幌病毒和猪嵴病毒均扩增不出任何目的片段，表明以该引物建立的PEDV疫苗株与野毒株RT-PCR鉴别方法具有良好的特异性。敏感性试验：将标准品按照2.0×103拷贝的RNA、2.0×102拷贝的RNA和2.0×101拷贝的RNA分别进行稀释，进行PT-PCR扩增，结果显示，本专利技术的试剂盒可以特异的检出PEDV的目的片段，且均可可检出至少200拷贝的RNA。检测结果：选用经过PCR扩增及测序结果为PEDV野毒株阳性的乳猪腹泻粪样30份和CV77及JS2008疫苗株个10份，采用本专利技术的猪PEDV疫苗株与野毒株RT-PCR鉴别方法检测，检测结果如表1，从表中可以看出，本专利技术的猪PEDV疫苗株与野毒株RT-PCR鉴别方法对PEDV疫苗株与野毒株病毒均可扩增出793bp的基因片段，只有野毒株才能扩增出505bp的基因片段而疫苗株不能扩增出505bp的基因片段，表明该引物能够鉴定PEDV阳性临床样品的检出率为100％，并能鉴别PEDV疫苗株与野毒株病毒。表1猪PEDV疫苗株与野毒株RT-PCR鉴别方法检测结果样品检测样品数量阳性样品数量Ps1/Pa2阳性率(％)Ps1/Pa1阳性率(％)PEDV野毒株3030100100CV77疫苗株10101000JS2008疫苗株10101000本专利技术的有益效果在于：经RT-PCR一步法扩增，电泳结果显示PEDV疫苗株与野毒株病毒均可扩增出793bp的基因片段，只有野毒株才能扩增出505bp的基因片段而疫苗株不能扩增出505bp的基因片段，表明该引物能够鉴定PEDV，并能鉴别PEDV疫苗株与野毒株病毒。将获得目的片段进行序列比较，证实目的片段是PEDV基因片段。确定Ps1、Pa1引物各5pmol、Pa2引物10pmol，退火温度在55℃时为最佳扩增条件，可分别获得PEDV505bp、793bp的与预期大小相符的目的片段。通过特异性试验、敏感性试验以及最后的检测结果可知本专利技术的猪PEDV疫苗株与野毒株RT-PCR鉴别方法能够鉴定PEDV，并能鉴别PEDV疫苗株与野毒株病毒，具有良好的特异性和敏感性。附图说明图1为PEDV疫苗株与野毒株差异序列，虚线部分为疫苗株缺失的24bp核苷酸序列。图2为特异性试验电泳结果，其中M列代表DL2000DNAmarker；1列代表PEDV经典株；2，3列代表PEDV变异株；4列代表PEDV疫苗株；5列代表TGEV；6列代表RV；7列代表PKV；8列代表HEV；9列代表阴性对照。图3为敏感性试验结果，其中M列代表DL2000DNAmarker；1列代表模板量为2.0×103拷贝；2列代表模板量为2.0×102拷贝；3列代表模板量为2.0×101拷贝；4列代表模板量为2拷贝；5列代表阴性对照。具体实施例本研究所要的材料的制备方法包括步骤。RNA的提取：本实验方法参照TaKaRaMiNiBESTViralRNA/DNAExtractionKitVer.5.0试剂说明书进行。PEDV疫苗株与野毒株RT-PCR鉴别：取200μLEP管，建立50μL的一步法RT-PCR反应体系，其中PrimeScript1StepEnzymeMix需要2μL、2×1StepBuffer需要25μＬ、RNA模板需要8μL、Ps1、Pa1和Pa2引物2.5pmol-10pmol，、RNasefreedH2O需要11μL，混匀后离心；所述一步法RT-PCR反应条件设定为50℃45min；94℃2min；94℃30s，50℃-60℃30s，72℃1min，35个循环；72℃15min；10℃停止；取7μLPCR扩增产物于1.2％的琼脂糖凝胶进行电泳，观察扩增结果，并回收目的条带进行序列测本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种猪流行性腹泻病毒疫苗毒与野毒株鉴别引物，其特征在于：所述病毒为PEDV疫苗毒CV777与野毒株，其差异基因序列为：GTCTTCCTGTGGCACCTGAAACAA；引物如下：Ps1，其序列为：ACACTATACTATCCCACCG；Pa1，其序列为：TTTCAGGAGCTACATTARG；Pa2，其序列为：CACCCAAAGATCCCAAGA；其中Ps1/Pa1引物对扩增片段长度为505bp；Ps1/Pa2引物对扩增片段长度为793bp。

【技术特征摘要】
1.一种猪流行性腹泻病毒疫苗毒与野毒株鉴别引物，其特征在于：所述病毒为PEDV疫苗毒CV777与野毒株，其差异基因序列为：GTCTTCCTGTGGCACCTGAAACAA；引物如下：Ps1，其序列为：ACACTATACTATCCCACCG；Pa1，其序列为：TTTCAGGAGCTACATTARG；Pa2，其序列为：CACCCAAAGATCCCAAGA；其中Ps1/Pa1引物对扩增片段长度为505bp；Ps1/Pa2引物对扩增片段长度为793bp。2.一种如权利要求1所述猪流行性腹泻病毒疫苗毒与野毒株鉴别引物的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：RNA的提取：本实验方法参照TaKaRaMiNiBESTViralRNA/DNAExtractionKitVer.5.0试剂说明...

【专利技术属性】
技术研发人员：李学瑞，兰喜，刘永生，丁耀中，周建华，马丽娜，王志林，
申请(专利权)人：中国农业科学院兰州兽医研究所，
类型：发明
国别省市：甘肃,62