一种玉米耐低温ZmColdG1序列SNP鉴定方法技术

本发明专利技术属于玉米耐低温鉴定技术领域，公开了一种玉米耐低温ZmColdG1序列SNP鉴定方法，玉米耐低温ZmColdG1序列的DNA为：SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3；SNP鉴定方法包括：进行玉米自交系幼苗培养；提取30份材料的DNA；PCR扩增出目的基因全长；进行测序。本发明专利技术已经扩出32个自交系的ZmColdG1序列的全长，已在外显子上发现29个突变位点，其中三个是非同义突变，分别是第二个外显子上W突变成L(突变位点1)，第7个外显子A‑V(突变位点2)，第7个外显子L‑Y(突变位点3；耐低温材料K10，黄C，沈5003同时出现突变位点1和3的非同义突变。

【技术实现步骤摘要】
一种玉米耐低温ZmColdG1序列SNP鉴定方法
本专利技术属于米耐低温鉴定
，尤其涉及一种玉米耐低温ZmColdG1序列SNP鉴定方法。
技术介绍
低温胁迫是影响植物正常生长的主要障碍因子之一，植物尤其是经济作物的抗低温性强弱直接影响作物产量。目前抗低温基因的鉴定多集中于拟南芥、水稻等模式植物以及玉米和棉花等重要农作物。他们多为热带起源的植物，都不能忍受冷环境，0℃～12℃即造成伤害。因此，亟需从其它抗低温性强的植物中挖掘相关基因。长期以来，人们对植物响应低温胁迫的机制已经从生理、生化、代谢、生态、以及遗传、进化等角度进行了很多研究，积累了丰富的知识。近年来，随着分子生物学的发展，人们进一步在基因组成、表达调控及信号传导等分子水平上加深了对植物耐低温机理的认识，为利用基因工程方法改良植物的耐低温性能提供了坚实的基础。由于植物抗逆性状的复杂性，采用传统的育种方法提高植物的耐低温性十分困难。转基因等基因工程方法为植物耐低温育种提供了有效途径，但高效耐低温基因的分离是限制植物耐低温基因工程的关键因素。玉米生长发育的早期阶段对低温胁迫十分敏感，此时低温冷害会影响种子萌发，延迟出苗时间，降低田间出苗率，抑制幼苗根茎叶的生长发育，阻碍光合作用，降低幼苗活力，极大地限制了其栽培范围和产量潜力。我国北方地区，尤其是东北春玉米区种植的玉米经常在出苗前后遭遇低温冷害，导致后期大面积减产。在这些区域，低温冷害已成为影响玉米早期生长发育的主要非生物逆境因素。玉米新品种选育是解决这一问题的重要途径，而鉴定和筛选耐低温玉米种质是选育耐低温品种的重要前提。目前，玉米种质耐低温性鉴定主要分为田间鉴定法和室内鉴定法。田间鉴定通常利用自然低温环境，必要时通过调整播期创造低温胁迫条件，直接观测相关性状评价耐低温特性。室内鉴定则利用人工生长箱等控制光温湿条件，然后测定相关形态及生理生化指标来进行耐冷评价。研究发现，田间耐低温性鉴定成本较高，需要异地重复鉴定，易受年份间气候条件变化影响，结果不够准确，所以通常需要室内鉴定，以获得较稳定可靠的试验结果。玉米在不同的生育时期都可能遭遇低温冷害，而萌发期是玉米对低温胁迫最为敏感的时期之一。迄今为止，国内外学者主要应用发芽势、发芽率、发芽指数、胚根长、胚芽长、存活率和电导率等鉴定指标进行玉米芽期耐低温性评价。在玉米耐低温鉴定中，为了消除不同材料遗传背景的差异，通常采用多种性状低温与常温下测定值的比值(相对值)作为衡量耐低温性强弱的指标。但由于多数情况下相对值间差异不显著，因此难以评价种质耐低温特性。综上所述，现有技术存在的问题是：现有技术对于玉米耐低温基因没有报道过，对于玉米耐低温基因内部的与耐低温密切相关的SNP位点没有进行克隆和没有开发成分子标记；而且现有技术没有进行扩出自交系的ZmColdG1序列，发现突变位点，为快速筛选耐低温自交系提供依据。
技术实现思路
针对现有技术存在的问题，本专利技术提供了一种玉米耐低温ZmColdG1序列SNP鉴定方法。玉米耐低温基因现有技术也没有报道过，本专利技术提供的玉米耐低温基因与耐低温有关，此基因本专利技术已经克隆出来，在此基因内部发现了2个与耐低温密切相关的SNP位点，并开发成分子标记。本专利技术是这样实现的，一种玉米耐低温ZmColdG1序列，所述玉米耐低温ZmColdG1序列的DNA为：SEQIDNO.1或SEQIDNO.2或SEQIDNO.3。本专利技术另一目的在于提供一种玉米耐低温ZmColdG1序列SNP鉴定方法包括：选择不同熟期，不同粒形，不同血缘，不同耐低温性的玉米自交系30份；进行幼苗培养；提取30份材料的DNA；PCR扩增出目的基因全长；进行测序。进一步，玉米自交系幼苗培养的方法，包括：每个自交系取5粒种子，用75％酒精消毒种子；37℃水浴催芽3h；种于发芽塑料发芽盒上，每个材料种于一个发芽盒内；每个发芽盒内插入标签，标记材料名称及时间；每2天浇水；叶片长到一叶一心期时，取样；每个样品取3份，一份用于基因组DNA提取，一份用于基因组RNA的提取，其余放于-80℃中保存备用。进一步，提取DNA的方法采用CTAB法，具体包括：在塑料2.0mL离心管管壁和盖子上标注玉米自交系编号，将0.3g玉米叶片剪碎放入离心管中，然后放入2颗直径5mm的钢珠，用盖子封闭离心管；将装有样品的离心管放入液氮中充分冷冻，然后置于振荡机中1200rpm上下振荡45s；对离心管内叶片没有粉碎的，再放入液氮中充分冷冻，重新振荡，直到玉米叶片呈粉末状；在离心管中加入1mL65℃预热的CTAB提取缓冲液上下颠倒；CTAB提取缓冲液使用前需加β-巯基乙醇；将离心管65℃水浴45min，每隔10min上下轻柔摇动混匀，使CTAB提取缓冲液和玉米叶片粉末接触；水浴结束后，取出离心管，冷却至室温，加入800μL氯仿和异戊醇的混合液，混合液中氯仿和异戊醇体积比为24:1；将离心管置于摇床上，以60rpm的速度摇动10min-15min；室温下12000rpm离心10min，转移750μL上清液到一个新的2mL离心管中；然后加入750μL氯仿异戊醇混合液，氯仿和异戊醇体积比为24:1；将新离心管置于摇床上，以60rpm的速度摇动10min-15min；室温下12000rpm离心10min，转移600μL上清液到1个1.5mL离心管中；加入600μL异丙醇，轻轻上下颠倒混匀，放置于-20℃的冰箱30min，然后12000rpm离心10min；弃去离心管中的液体，在管底得到白色沉淀的含有杂质的基因组DNA，加入70％的乙醇漂洗，漂洗30min；重复进行弃去离心管中的液体，在管底得到白色沉淀的含有杂质的基因组DNA，加入70％的乙醇漂洗，漂洗30min；然后用95％的乙醇漂洗10min，弃95％的乙醇；倒掉95％的乙醇后在室温晾干；晾干后的DNA加入200μLddH2O，加入0.05μLRnaseA，在37℃保温1h溶解RNA；然后测定DNA的浓度和质量后放入4℃冰箱保存备用。进一步，测定DNA的浓度采用琼脂糖凝胶电泳DNA检测方法，包括：取待检测耐低温性的玉米自交系植株叶片DNA溶液3μL，ddH2O3μL，6×loadingBuffer2μL；采用1％的琼脂糖凝胶电泳检测。进一步，PCR扩增出目的基因全长后，对PCR扩增出目的基因进行琼脂糖凝胶电泳检测，具体包括：取扩增后PCR目的基因3μL，6×loadingBuffer2μL进行1％琼脂糖凝胶电泳检测：按照1g琼脂糖粉加入100ml的1×TAE电泳缓冲液的比例称取相应的琼脂糖粉放于250mL锥形瓶中，加入1×TAE电泳缓冲液，微波炉加热至完全溶解，冷却至60℃后加入溴化乙锭溶液EB至终浓度0.5μg/ml，摇匀；胶槽水平放置，插放梳子，倒入胶液形成水平的胶面；待胶凝固后拔起梳子，放入电泳槽中；在电泳槽内加入新配置的1×TAE电泳缓冲液至淹没琼脂糖胶块；在新的PCR板内混匀待测样品3μL和2μL的6×LoadingBuffer，用移液枪转移至加样孔中；第一个泳道点入相应的MARKER标准分子量；点样孔放置在近阴极端，在电压5V/cm电压中进行电泳；待溴酚蓝移动至4cm-5cm处停止电泳；在GelDocXR+成像系统中进行分析；得出结果，储存于电本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种玉米耐低温ZmColdG1序列，其特征在于，所述玉米耐低温ZmColdG1序列的DNA为：SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3。

【技术特征摘要】
1.一种玉米耐低温ZmColdG1序列，其特征在于，所述玉米耐低温ZmColdG1序列的DNA为：SEQIDNO.1或SEQIDNO.2或SEQIDNO.3。2.一种如权利要求1所述玉米耐低温ZmColdG1序列的SNP鉴定方法，其特征在于，所述玉米耐低温ZmColdG1序列SNP鉴定方法包括：选择30份不同熟期，不同粒形，不同血缘，不同耐低温性的玉米自交系；进行幼苗培养；提取30份材料的DNA；PCR扩增出目的基因全长；进行测序。3.如权利要求2所述玉米耐低温ZmColdG1序列SNP鉴定方法，其特征在于，玉米自交系幼苗培养的方法，包括：每个自交系取5粒种子，用75％酒精消毒种子；37℃水浴催芽3h；种于塑料发芽盒上，每个材料种于一个发芽盒内；每个发芽盒内插入标签，标记材料名称及时间；每2天浇水；叶片长到一叶一心期时，取样；每个样品取3份，一份用于基因组DNA提取，一份用于基因组RNA的提取，其余放于-80℃中保存备用。4.如权利要求2所述玉米耐低温ZmColdG1序列SNP鉴定方法，其特征在于，提取DNA的方法采用CTAB法，具体包括：在塑料2.0mL离心管管壁和盖子上标注玉米自交系编号，将0.3g玉米叶片剪碎放入离心管中，然后放入2颗直径5mm的钢珠，用盖子封闭离心管；将装有样品的离心管放入液氮中充分冷冻，然后置于振荡机中1200rpm上下振荡45s；对离心管内叶片没有粉碎的，再放入液氮中充分冷冻，重新振荡，直到玉米叶片呈粉末状；在离心管中加入1mL65℃预热的CTAB提取缓冲液上下颠倒；CTAB提取缓冲液使用前需加β-巯基乙醇；将离心管65℃水浴45min，每隔10min上下轻柔摇动混匀，使CTAB提取缓冲液和玉米叶片粉末接触；水浴结束后，取出离心管，冷却至室温，加入800μL氯仿和异戊醇的混合液，混合液中氯仿和异戊醇体积比为24:1；将离心管置于摇床上，以60rpm的速度摇动10min-15min；室温下12000rpm离心10min，转移750μL上清液到一个新的2mL离心管中；然后加入750μL氯仿异戊醇混合液混合液，氯仿和异戊醇体积比为24:1；将新离心管置于摇床上，以60rpm的速度摇动10min-15min；室温下12000rpm离心10min，转移600μL上清液到1个1.5mL离心管中；加入600μL异丙醇，轻轻上下颠倒混匀，放置于-20℃的冰箱30min，然后12000rp...

【专利技术属性】
技术研发人员：周羽，王振华，邸宏，董玲，
申请(专利权)人：东北农业大学，
类型：发明
国别省市：黑龙江,23