本发明专利技术涉及马铃薯染色体Ⅺ末端抗低温糖化相关的QTL位点的SNP标记方法及其应用，属于植物分子遗传育种领域。马铃薯抗低温糖化相关的QTL位点的SNP标记为SNP11‑70，该SNP位于PGSC_DM_v4.03的11号染色体第43142833个碱基处。利用SNP11‑70开发基于限制性内切酶SapⅠ区分的CAPS标记，将SNP标记转化为CAPS标记。利用该标记对不同抗低温糖化能力的品种(自然群体)进行相关分子标记多态性分析，同时测定自然群体还原糖含量。分析了标记和低温糖化抗性之间的相关性，标记和表型之间的相关系数为0.293**，差异达到极显著水平(P小于0.01)。本发明专利技术提供的马铃薯染色体Ⅺ末端抗低温糖化相关的QTL位点的SNP标记可用于马铃薯抗低温糖化性状的早期分子辅助选择，以提高育种效率。
【技术实现步骤摘要】
马铃薯染色体Ⅺ末端抗低温糖化相关的QTL位点的SNP标记及其应用
本专利技术属于分子遗传育种领域，提供了马铃薯染色体Ⅺ末端抗低温糖化相关的主效QTL位点及SNP标记开发方法，可用于马铃薯抗低温糖化性状的早期分子辅助选择，以提高育种效率。
技术介绍
马铃薯(SolanumtuberosumL.)是世界第四大粮食作物，用途广泛，尤其加工产品深受人们的喜爱。在生产上，为了保证马铃薯加工产品的周年供应，通常将收获后的块茎贮藏在低温(7℃)件下。而这种低温贮藏却常使块茎内的淀粉转化加速转化为还原糖，并且扩散到整个块茎，这种现象就是通常所说的低温糖化。高温油炸加工时，块茎中的还原糖与游离的氨基酸发生非酶促的迈拉尔德反应(Mai1lardreaction)(Shallenbergeretal1969)，致使炸片颜色变为黑色或者褐色、口感变差，并产生具有神经毒性的丙烯酰胺，严重影响了加工产品的产量与质量，给马铃薯加工业带来巨大的经济损失。因此，解析马铃薯低温糖化遗传机制，寻找与低温糖化抗性关联的分子标记，成为选育出抗低温糖化的马铃薯栽培品种的关键。目前在全世界广泛栽培的马铃薯均为四倍体普通栽培种，属于高度杂合的同源四倍体，遵循四体遗传规律；同时，马铃薯是自花授粉植物还存在自交不亲和以及自交衰退的现象。因此，关于马铃薯的一些重要性状的遗传规律研究十分不易，同时也为开展目标性状的遗传改良带了巨大的障碍。20世纪以来，随着分子标记技术的迅速发展、高密度的遗传图谱的出现，以及数量性状作图法方法的完善，为马铃薯的分子遗传研究奠定了基础，尤其是针对数量性状的研究。利用分子标记定位数量性状的QTL，实质是通过分析目标性状与分子标记之间的连锁关系，来确定QTL的具体位置。基于获得的表型与基因型之间的相关性分析，可开发应用于分子标记辅助选择的育种技术，已经在许多重要农作物种取得了成功应用。近年来，随着分子标记技术的发展，马铃薯块茎低温糖化的分子遗传学研究取得了重要进展。Chen等(2001)利用一个马铃薯双单倍体群体(2n＝24)，构建了第一个与马铃薯碳水化合物代谢相关的功能分子(moleculor-function)图谱，定位了涉及69个相关基因的85个QTL标记。随后，Menéndz等(2002)利用2个双单倍体群体，针对低温糖化性状筛选并定位了26个QTL标记。国内金黎平(2002)也利用二倍体群体，通过AFLP和SSR标记进行了QTL定位，定位结果显示，19个QTL分别分布在3、6、8、12、13、14、15和16号连锁群上，解释的表型变异幅度为5.50％-70％。在关联分析方面，D’hoop(2002)利用AFLP标记与薯片或薯条的色泽进行了相关分析，结果显示，经过4℃贮藏后块茎炸片色泽相关标记位于马铃薯的1、6、7、8、9和12号染色体上，经过8℃贮藏后块茎炸片色泽相关标记位于马铃薯的1、2、4、5、6、9和10号染色体上，其中8℃和4℃贮藏后炸片色泽只有一个位点相重叠。所有这些研究都显示，马铃薯块茎的低温糖化是一个能稳定遗传的性状，存在利用分子标记辅助选择的可能。本实验室利用二倍体马铃薯亲本以及178个后代建立了双亲连锁图谱，定位了二倍体马铃薯低温糖化相关性状的QTL，分别分布在2，3，4，5，6，7，8，10和11号染色体上。首次报道了马铃薯染色体Ⅺ末端存在与低温糖化相关的QTL，并且该QTL在多年田间试验中稳定存在，遗传效应明显。但是，后续研究中发现，该QTL区间最近2个标记之间的遗传距离是30cM，存在一段空白区域，并且还没有任何报道表明该区域存在与马铃薯抗低温糖化相关基因存在。因此，解析马铃薯染色体Ⅺ末端低温糖化的遗传机制，寻找与低温糖化抗性关联的分子标记，对于加工品种选育具有重要意义。
技术实现思路
鉴于现有技术的不足，本专利技术提供了马铃薯染色体Ⅺ末端抗低温糖化相关的QTL位点的SNP标记及其应用；其目的是精细定位马铃薯染色体Ⅺ末端抗低温糖化相关的QTL，并且基于定位结果开发一种应用于马铃薯抗低温糖化新品种选育的SNP标记，为马铃薯抗低温糖化分子标记辅助选择体系建立奠定基础，以提高育种效率。为了达到上述目的，本专利技术采用了如下的技术方案：一种与马铃薯抗低温糖化相关的主效QTL位点紧密连锁的SNP标记引物，其特征在于：正向引物序列SNP11-70-F为‘5-CTACCCCTTTTATGTCTCCCGC-3’反向引物SNP11-70-R为‘5-AACCGAAACCGTAGCCTGAG-3’。该SNP位点位于PGSC_DM_v4.03基因组序列上染色体Ⅺ的第43142833个碱基处，首先利用目标区域捕获测序技术检测该位点在EB群体后代中的多态性，然后将SNP标记转化为CAPS标记。利用该标记对不同抗低温糖化能力的品种(系)进行相关分子标记多态性分析和低温还原糖含量测定，并分析标记和低温糖化抗性之间的相关性，为马铃薯抗低温糖化分子标记辅助选择体系建立奠定基础，以提高育种效率。本专利技术提供了所述的马铃薯抗低温糖化分子标记获得的方法，包括以下步骤：⑴以母本ED25和父本CW2-1以及两者杂交产生的后代作为材料。⑵提取材料的基因组DNA。⑶利用RNA-seq方法高通量测序，对ED25和CW2-1进行分析，获得双亲之间的差异SNP位点。⑷根据⑶中测序结果，挑选马铃薯染色体11末端差异SNP位点，利用定制化目标捕获测序技术(项目流程图见附图1)分析EB群体172个后代的基因型，用于连锁图谱的构建。结合低温下块茎还原糖含量测定结果，获得马铃薯抗低温糖化的QTL，将其命名为CISEB11(QTL的名称由CIS和群体名(EB群体)以及染色体号组成)，该QTL对应的SNP标记为SNP11-70。⑸根据⑷中定位的结果，将SNP标记转化为CAPS标记，在自然群体中进行多态性验证。同时对自然群体的低温糖化抗性进行鉴定，进行SNP标记和低温糖化抗性之间的相关性分析。优选的，所述方法步骤⑸中，将SNP标记转化为CAPS标记所用的方法如下：从http://potato.plantbiology.msu.edu/pgsc_download.shtml上下载PGSC_DM_v4.03基因组序列，搜索11号染色体上SNP位点SNP11-70的DNA序列，选取该位点前后1000bp的序列。利用snapgene软件查看，该SNP位点能够被限制性内切酶SapI区分，将SNP标记转化为CAPS标记。依据引物设计原则，开发设计CAPS标记引物。正向引物序列SNP11-70-F为‘5-CTACCCCTTTTATGTCTCCCGC-3’；反向引物SNP11-70-R为‘5-AACCGAAACCGTAGCCTGAG-3’。扩增产物大小737bp,利用限制性内切酶SapI酶切后的片段大小分别为454bp和283bp。优选的，所述方法步骤⑸中，将SNP标记转化为CAPS标记后利用上述引物对自然群体进行扩增的反应体系为20μl，具体如下：DNA模板(50ng/μl)1μl，上下游引物(10μM)各0.5μl，UtaqPCRMix(2×)10μl，,ddH2O8μl。反应程序采用TouchdownPCR程序：95℃预变性3min，然后12循环依次经过95℃变性30s、Ta℃(每本文档来自技高网...
【技术保护点】
马铃薯低温糖化抗性的分子标记的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：⑴以母本ED25(低温糖化敏感亲本)和父本CW2‑1(抗低温糖化亲本)以及两者杂交产生的后代作为群体分析材料；⑵提取材料的基因组DNA；⑶利用RNA‑seq方法进行高通量测序，对ED25和CW2‑1进行分析，获得双亲之间的差异SNP位点；⑷根据步骤⑶中测序结果，挑选马铃薯染色体11末端差异SNP位点，利用定制化目标捕获测序技术分析EB群体172个后代的基因型，用于连锁图谱的构建，结合低温下块茎还原糖含量测定结果，获得马铃薯抗低温糖化的QTL，将其命名为CISEB11(QTL的名称由CIS和群体名(EB群体)以及染色体号组成)，与该QTL紧密连锁的SNP标记为SNP11‑70。
【技术特征摘要】
1.马铃薯低温糖化抗性的分子标记的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：⑴以母本ED25(低温糖化敏感亲本)和父本CW2-1(抗低温糖化亲本)以及两者杂交产生的后代作为群体分析材料；⑵提取材料的基因组DNA；⑶利用RNA-seq方法进行高通量测序，对ED25和CW2-1进行分析，获得双亲之间的差异SNP位点；⑷根据步骤⑶中测序结果，挑选马铃薯染色体11末端差异SNP位点，利用定制化目标捕获测序技术分析EB群体172个后代的基因型，用于连锁图谱的构建，结合低温下块茎还原糖含量测定结果，获得马铃薯抗低温糖化的QTL，将其命名为CISEB11(QTL的名称由CIS和群体名(EB群体)以及染色体号组成)，与该QTL紧密连锁的SNP标记为SNP11-70。2.一种马铃薯低温糖化抗性的检测方法，其特征在于，采用马铃薯抗低温糖化相关的主效QTL位点紧密连锁的SNP标记引物对不同基因型的马铃薯基因组提取物进行PCR扩增，将扩增产物用限制性内切酶SapⅠ进行酶切消化，酶切产物用1％的琼脂糖凝胶检测，并经DNA测序验证。3.根据权利要求2所述一种马铃薯低温糖化抗性的检测方法，其特征在于，所述马铃薯抗低温糖化相关的主效QTL位点紧密连锁的SNP标记引物为：正向引物序列SNP11-70-F为5’-CTACCCCTTTTATGTCTCCCGC-...
【专利技术属性】
技术研发人员：宋波涛，黄维，肖桂林，谢从华，柳俊，李春燕，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：湖北,42
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