白芍品种鉴定的引物、试剂盒、鉴定方法技术

本发明专利技术为一种白芍品种鉴定的引物、试剂盒、鉴定方法。该方法分别包括以下步骤：(1)提取不同品种的已知白芍DNA，分别加SEQ ID No.1至SEQ ID No.12所示的PCR引物进行PCR反应，分离所得已知白芍PCR反应产物，得到第一结果；(2)提取待测白芍DNA，分别加入SEQ ID No.1至SEQ ID No.12所示的PCR引物对进行PCR反应，分离所得待测白芍PCR反应产物，得到第二结果；(3)分析第一结果及所述第二结果，得出鉴定结果。该方法为白芍品种的区分提供一种简单有效可靠的分子鉴定手段，相比传统形态鉴别，不受采样时期和采样部位的限制，从基因层面对其进行鉴别区分，为解决白芍品种混乱和品种优劣区分提供新型鉴定手段。

【技术实现步骤摘要】
白芍品种鉴定的引物、试剂盒、鉴定方法
本专利技术涉及属于分子生物学领域，涉及植物的品种分子鉴别方法，特别是白芍品种鉴定的引物、试剂盒、鉴定方法。
技术介绍
白芍，别名芍药，《中国药典》2015版载其原植物为毛茛科芍药属植物芍药(PaeonialactifloraPall.)经去皮水煮加工后的干燥根。其性味苦、酸，微寒。归肝、脾经。具有养血敛阴，柔肝止痛，平抑肝阳的功效。临床上多用于头痛眩晕，胁痛，腹痛，四肢挛痛，血虚萎黄，月经不调，自汗，盗汗等症。白芍主产于中国安徽、四川、浙江、山东等地。目前白芍的繁殖主要采用分根无性繁殖，大部分人工栽培的白芍仅仅经过短期的引种和驯化，可能存在着一些经过多年选择但未完全纯化的地方优良品种。如浙江磐安、安徽亳州、四川中江和山东菏泽作为白芍的传统产区，在长期的引种和交流中，种质资源较为混杂，更是出现了一些同种异地，或者同产地不同种的现象，白芍种质资源的遗传结构有较大程度的差异，品种退化严重，栽培种质混杂。道地性白芍和非道地性白芍外观形态，质地纹理都十分相似，而传统形态学上的特征研究并不能较好的体现出其中的差异，无法准确的区分白芍的道地性。分子生物学的快速发展，为道地性白芍和非道地性白芍的区分提供了有效可靠的鉴定手段，为白芍的引种和培育工作提供了技术支持。白芍是中国传统常用大宗中药材，种植面积大，品种繁多，严重影响了白芍规范化生产的发展。因此有必要从源头即白芍种质资源、种植规范方面严格要求，搞清白芍药材的地道性，建立品种质量标准，从而指导GAP中药材生产质量管理规范标准化生产。
技术实现思路
基于上述要求本专利技术主要提供一种白芍品种鉴定的引物、试剂盒、鉴定方法。本专利技术的技术方案是通过如下技术方案实现的：用于白芍品种鉴定的PCR引物，选自SEQIDNo.1至SEQIDNo.12中的至少两条。在其中一些实施例中，所述PCR引物选自SEQIDNo.1至SEQIDNo.12中的十二条。在其中一些实施例中，所述PCR引物的使用浓度为0.3～0.6μmol/L。本专利技术是通过引物筛选得到上述的引物，对白芍DNA进行PCR扩增，所得结果表现出白芍品种的差异，以该方法对白芍品种进行检测，简单准确稳定且重复性好。用于白芍品种鉴定的试剂盒，包括上述的PCR引物。在其中一些实施例中，所述的试剂盒还包括反应液，所述反应液包括DNA聚合酶、镁离子、dNTPs。在其中一些实施例中，所述DNA聚合酶的浓度为0.5～1.25U/20μL；所述镁离子的浓度为1.5～3mmol/L；所述dNTPs的浓度为0.1～0.25mmol/L。最终得到的反应体系扩增效果好，能够得到稳定且清晰的电泳条带，有利于后续试验的鉴别和分析。一种白芍品种的鉴定方法，包括如下步骤：(1)提取不同品种的已知白芍DNA，分别加入上述的PCR引物进行PCR反应，分离所得已知白芍PCR反应产物，得到第一结果；(2)提取待测白芍DNA，分别加入上述的PCR引物对进行PCR反应，分离所得待测白芍PCR反应产物，得到第二结果；(3)分析所述第一结果及所述第二结果，得出鉴定结果。本专利技术以DNA水平的分子标记为基础，建立了上述白芍品种的分子鉴定方法，为解决白芍市场品种混乱和优劣问题提供了一种新型的便利手段。也为白芍的引种和培育提供了技术支持。该方法快速简便，只要少量样本即可实现，可用于鉴别白芍种苗，从基因水平选择白芍种植品种，从源头保障药材质量。在其中一些实施例中，所述第一结果为将已知白芍PCR反应产物所含片段记为1、未含有片段记为0所得到的0/1矩阵；所述第二结果为将待测白芍PCR反应产物所含片段记为1、未含有片段记为0所得到的0/1矩阵。在其中一些实施例中，所述步骤(3)包括：采用通用NTSYS-pc软件计算已知白芍、待测白芍间的相似系数，并用不加权成对算术平均法建立聚类树图谱。在其中一些实施例中，所述PCR反应的程序为：94℃预变性5min；94℃变性45s，53～59℃退火45s，72℃延伸90s，35个循环；72℃延伸10min，最后4℃保存。上述反应程序适合白芍的PCR扩增反应，得到了良好的扩增效果，PCR产物稳定清晰，有利于后续实验结果的鉴别和分析。在其中一些实施例中，所述退火的温度为53℃、56℃、57℃或59℃。与现有技术相比，本申请具备如下有益效果：专利技术人经过长期的实验和研究，本专利技术针对白芍品种，获得具有代表性的引物。进一步地，创造性地选择了合适的引物组合，该引物组合中的不同引物序列能够适用于同一扩增条件及反应程序，用其对不同品种的白芍进行PCR扩增，最终能够获得多态性最丰畗，且准确性高、稳定性好、可重复性强的结果。基于本申请引物组合的鉴定方法，为解决品种混乱和品种优劣问题提供了有效可靠的鉴定手段，也为白芍的引种和培育工作提供了技术支持；不受采样部位和采样时期的限制，从基因层面对其进行鉴别和区分，从源头上控制药材质量和提供用药安全保障，为白芍的引种和大面积选苗培育提供了有利的技术支持；该方法快速简便，样品需求量少。附图说明图1正交体系优化电泳图，其中，1～16分别为正交1～16组不同PCR反应体系；图236条引物初筛电泳图，其中，编号1-36分别为S1-S36号引物；图3S29和S30在8个温度梯度下扩增电泳图，其中1-8分别为50℃-60℃梯度温度；图4部分引物多态性筛选，其中，a：安徽白芍A1，b：四川白芍C1，c：浙江白芍Z1；图5S6引物对22份材料SCoT-PCR扩增电泳图，其中，1-22为样品表中依次排序的A1-J号样品；图6S25引物对22份材料PCR扩增电泳图：1-22为样品表中依次排序的A1-J号样品；图722个不同产地白芍样品的聚类分析图。具体实施方式以下结合具体实施例对本专利技术白芍品种鉴定的引物、试剂盒、鉴定方法作进一步详细的说明。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件，实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。除非另有定义，本专利技术所使用的所有的技术和科学术语与属于本专利技术的
的技术人员通常理解的含义相同。本专利技术的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本专利技术。本专利技术所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。实施例11.以下实施例中实验仪器、试剂和材料仪器：核酸蛋白测定仪(ImplenNanophotometer)、PCR扩增仪(BIO-RAD)、高速离心机(Eppendorf5418)、超低温冰箱(Thermo902-ULTS)、电泳仪、电泳槽(BIO-RAD)、凝胶成像系统(Bio-Rad)。试剂：ExTaqDNA聚合酶(Takara，5U/μL)、dNTP(Takara，2.5mM)、DNAmarker(广州东盛生物科技有限公司)、10×LoadingBuffer(Tiangen)、琼脂糖(Biowest)、GoldenView(北京博凌科为生物科技有限公司)。引物序列如下表1：表1本申请采用的扩增引物实验材料：采集来自浙江，山东，四川，安徽四个不同产地的22个白芍样品，对样品进行编号和信息记录，用75％(v/v)乙醇清洁叶表面后保存于-80℃冰箱备用，具体情况见下表。表2样品信息表2.实验方法(1本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于白芍品种鉴定的PCR引物，其特征在于，选自SEQ ID No.1至SEQ ID No.12中的至少两条。

【技术特征摘要】
1.用于白芍品种鉴定的PCR引物，其特征在于，选自SEQIDNo.1至SEQIDNo.12中的至少两条。2.根据权利要求1所述的用于白芍品种鉴定的PCR引物，其特征在于，选自SEQIDNo.1至SEQIDNo.12中的十二条。3.根据权利要求1或2所述的用于白芍品种鉴定的PCR引物，其特征在于，其在扩增体系中的浓度为0.3～0.6μmol/L。4.用于白芍品种鉴定的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1至3任一项所述的PCR引物。5.根据权利要求4所述的用于白芍品种鉴定的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒还包括反应液，所述反应液包括DNA聚合酶、镁离子、dNTPs。6.根据权利要求5所述的用于白芍品种鉴定的试剂盒，其特征在于，所述DNA聚合酶的浓度为0.5～1.25U/20μL；所述镁离子的浓度为1.5～3mmol/L；所述dNTPs的浓度为0.1～0.25mmol/L。7.一种白芍品种的鉴定方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)提取不同品种的已知白芍DNA，分别加入权利要求1至3任一项所述的PCR引物进行P...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡珊，王永辉，曾仑，连林生，周劲松，席秀利，
申请(专利权)人：广州市香雪制药股份有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44