一种用于诊断原发性肝癌的血清特异性生物标志物及筛选方法与应用技术

一种用于诊断原发性肝癌的血清特异性生物标志物及筛选方法与应用，利用Boyden小室分离肝癌转移细胞的突出与胞体，从亚细胞结构出发，运用改良的Boyden小室法分离肝癌转移细胞胞体和突出，利用Western‑blot、RNA染色、免疫荧光等技术验证分离结果。研究在HCCLM3 肝癌细胞胞体与突出中差异表达的情况、筛选出与HCC浸润转移过程有关的微小RNA，在临床上实验证明个体血清hsa‑let‑7c‑3p的变化对于HCC的诊断有较高的灵敏度及特异性。本发明专利技术将为临床诊断原发性肝癌提供一种新的诊断手段，在辅助HCC的治疗以及病程监测上有一定的潜在临床价值，通过let‑7c‑3p的ROC曲线，以及let‑7c‑3p与CEA联用、let‑7c‑3p与AFP联用、let‑7c‑3p与AFP和CEA联用的ROC曲线，提高了灵敏度及特异性，诊断价值得到了明显的提高。

【技术实现步骤摘要】
一种用于诊断原发性肝癌的血清特异性生物标志物及筛选方法与应用
本专利技术具体涉及分子生物
，具体涉及一种用于诊断原发性肝癌的血清特异性生物标志物及筛选方法与应用。
技术介绍
肝细胞性肝癌（Hepatocellularcarcinoma，HCC）是世界范围内的第五种最常见的恶性肿瘤。尽管这些年在HCC的诊疗上有很大的进步，但由于临床上HCC经常会有复发和转移，HCC患者的5年生存率仍然相当低。HCC的发生和发展是一个典型的多阶段过程：首先是肝脏组织在外界刺激下（B型肝炎病毒（HBV）或丙型肝炎病毒（HCV）感染、黄曲霉毒素B1的摄入量或酒精滥用等）发生慢性肝炎或肝硬化，然后在经历一系列增生和不典型增生阶段后，最终获得肝内转移和远端转移的恶性表型。肿瘤的浸润转移是指肿瘤细胞脱离其原发部位，向其它部位传播，进而浸润正常组织，并经过淋巴道、血管或体腔及其它方式，转运到继发的靶组织或器官，从而继续增殖生长，形成与原发肿瘤相同性质的继发肿瘤的过程。细胞开始形成局部浸润和远处转移能力是恶性肝肿瘤早期特有的性质，因此研究肝肿瘤细胞浸润和转移初期机制对临床诊疗有十分重要的意义。而肝癌的进展涉及到很多调控细胞周期调控、细胞生长、细胞凋亡、细胞迁移的关键基因（见图2）。近年来在HCC的基础与临床研究方面虽然取得了一些进展，但始终未能阐明HCC转移复发的机制。因此，寻找有效的转移复发抑制途径，已成为进一步提高生存率的关键。研究提示，在人类肿瘤中，microRNA（miRNAs）既可以作为癌基因促进肿瘤的发生和发展，也可以发挥抑癌基因的功能抑制肿瘤。寻找肿瘤相关的miRNAs，并探讨其具体作用的机制或其成为新的分子诊断标志物，已成为肿瘤相关研究中的新方向。miRNAs的异常表达参与肿瘤的发生和发展，在肿瘤产生、癌细胞增殖和调亡、肿瘤的血管发生、侵袭和转移等方面发挥着重要的作用。相应的研究亦证实：某些miRNAs在HCC的肿瘤产生、肿瘤细胞增殖和凋亡、肿瘤的血管发生、侵袭和转移等方面发挥着重要的作用。研究发现miRNAs在肝癌组织中经常表达失调，并且一些特定的miRNAs与肝癌的转移、复发和预后等临床病理特征相关。因此，miRNA可能作为HCC新的分子诊断标志物和治疗靶点。
技术实现思路
为了解决现有技术的不足，本专利技术的提供了一种用于诊断原发性肝癌的血清特异性生物标志物及筛选方法与应用。一种改良的肝癌转移细胞胞体和突出的分离方法。本专利技术采用的技术解决方案是：一种用于诊断原发性肝癌的血清特异性生物标志物，所述的特异性生物标志物为miRNAhsa-let-7c-3p。一种用于诊断原发性肝癌的血清特异性生物标志物的筛选方法，包括以下步骤：(1)建立HCCLM3细胞模型(2)从已建成的细胞模型中分离细胞突出和细胞体；(3)从分离的细胞突出和细胞体中分别提取RNA；(4)在前期miR-SEQ测序结果内筛选本体表达高且差异倍数大的候选miRNAs；(5)收集HCC患者组织、血浆样本及临床资料，提取miRNA；(6)将抽提的miRNA逆转录为cDNA；(7)进一步用实时荧光定量PCR分析方法对正常人和HCC患者进行逐个验证筛选，并对筛选出具有监测肝细胞性肝癌转移性的特异性生物标志物的miRNA并对临床价值进行评估。一种检测原发性肝癌的试剂盒，所述的试剂盒包括有检测特异性生物标志物hsa-let-7c-3p的试剂。一种检测原发性肝癌的试剂盒，所述的检测特异性生物标志物hsa-let-7c-3p的试剂包含一对特异性引物，引物序列为：FPrimer:GGCGAGTCTGTACAACCTTCTAG；RPrimer:TATGGTTTTGACGACTGTGTGAT。一种特异性生物标志物hsa-let-7c-3p在作为肝细胞性肝癌转移性指标上的应用。一种特异性生物标志物hsa-let-7c-3p联用肿瘤生物标志物AFP、CEA在作为肝细胞性肝癌转移性指标上应用。本专利技术的有益效果是：本专利技术提供了一种用于诊断原发性肝癌的血清特异性生物标志物及筛选方法与应用，在临床上实验证明个体血清hsa-let-7c-3p的变化对于HCC的诊断有较高的灵敏度及特异性。本专利技术将为临床诊断原发性肝癌提供一种新的诊断手段，在辅助HCC的治疗以及病程监测上有一定的潜在临床价值，通过let-7c-3p的ROC曲线，以及let-7c-3p与CEA联用、let-7c-3p与AFP联用、let-7c-3p与AFP和CEA联用的ROC曲线，提高了灵敏度及特异性，诊断价值得到了明显的提高。附图说明图1为本专利技术miRNA筛选及制备的主要流程。图2为显示正常细胞和经过诱导的恶性肿瘤细胞突出形态的对比图。图3为Boyden培养皿法分离肝癌细胞突出和细胞体。图4、5为显示RNA-seq中显示出的miRNA差异表达。图6为HCCLM3细胞株免疫荧光实验结果图。图7为HCCLM3细胞株EtBr染色实验结果图。图8为免疫荧光和免疫印迹法检验Boyden培养皿分离法有效性荧光图。图9为Ladder质检峰图。图10为HCCLM3肝癌转移细胞突出质检峰图。图11为HCCLM3肝癌转移细胞胞体质检峰图。图12为显示差异小RNA的靶基因GO显著性富集分析。图13、14为RNA-seq实验方案。图15为显示正常细胞和经过诱导的恶性肿瘤细胞突出形态的对比图。图16、17为肝细胞肝癌与健康对照组在let-7c-3p中的表达差异。图18为let-7c-3p以及与AFP、CEA联用时的ROC曲线。图19为Boyden模式图。具体实施方式现结合具体内容对本专利技术进行进一步说明，下面结合具体实施方式，进一步阐述本专利技术。这些实施例仅用于说明本专利技术而不用于限制本专利技术的范围。此外应理解，在阅读了本专利技术记载的内容之后，本领域技术人员可以对本专利技术作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。材料和方法实验仪器表1主要实验仪器名称及生产厂家实验材料表2主要实验试剂及耗材名称及生产厂家细胞系高转移肝癌细胞系HCCLM3为本实验室液氮中保存，最初均购于中国科学院上海细胞库。引物设计合成引物设计合成由上海吉玛制药技术有限公司合成。引物处理如下：减压离心干燥品，制品干燥于管底，为干粉状。加入100μLDEPC水溶解引物，配成终浓度10μmol/L，置于-20°C冰箱保存。表3hsa-let-7c-3p及相应PCR引物对序列病例来源所有实验组对象均来自2016年1月至2016年5月在温州医科大学第二附属医院就诊的确诊原发性肝细胞型肝患者，共计21例；健康对照组来自温州医科大学第二附属医院健康查体中心，共计21例。血清样本处理将采集的到的全血标本采用EDTA抗凝法处理后，在4℃下4,000rpm离心10分钟全血标本得到血清。用500μL去RNA酶处理EP管对血清样本进行分装，分装后置于-80℃冰箱保存。方法1.HCCLM3细胞的传代培养（1）关闭紫外，打开风机，点燃酒精灯；（2）75%酒精擦拭超净工作台、双手以及所用器械、试剂瓶、细胞培养皿；（3）细胞用2mLPBS洗2遍；（4）加入胰酶2~3mL消化1.本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于诊断原发性肝癌的血清特异性生物标志物，其特征在于，所述的特异性生物标志物为miRNA hsa‑let‑7c‑3p。

【技术特征摘要】
1.一种用于诊断原发性肝癌的血清特异性生物标志物，其特征在于，所述的特异性生物标志物为miRNAhsa-let-7c-3p。2.一种权利要求1所述的用于诊断原发性肝癌的血清特异性生物标志物的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)从已建成的细胞模型中分离细胞突出和细胞体；(2)从分离的细胞突出和细胞体中分别提取RNA；(3)在前期miR-SEQ测序结果内筛选本体表达高且差异倍数大的候选miRNAs；(4)收集HCC患者组织、血浆样本及临床资料，提取miRNA；(5)将抽提的miRNA逆转录为cDNA；(6)进一步用实时荧光定量PCR分析方法对正常人和HCC患者进行逐个验证筛选，并对筛选出具有监测肝细胞性肝癌转移性的特异性生物标志物的miRNA...

【专利技术属性】
技术研发人员：季敬璋，申志发，冯笑，金玉，龚莉莎，胡雪梅，
申请(专利权)人：温州医科大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33