一种植物生物技术领域的基因启动子，所述启动子的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；AaTCP15基因启动子能够调控目的基因在植物各组织中表达，尤其是分泌型腺毛和非分泌型腺毛中优势表达。同时本发明专利技术还涉及前述AaTCP15基因启动子在利用植物腺毛组织表达和生产代谢产物的基因工程育种中的用途。由于腺毛优势表达的启动子对植物的腺毛系统进行遗传操作，不会对植物的生长发育造成危害，本发明专利技术对利用植物腺毛组织表达和生产代谢产物的基因工程育种具有重要意义。
【技术实现步骤摘要】
青蒿腺毛优势表达AaTCP15基因启动子及应用
本专利技术涉及的是一种分子生物学领域的技术，具体是一种青蒿腺毛优势表达AaTCP15基因启动子及应用。
技术介绍
青蒿(ArtemisiaannuaL.)是菊科(Asteraceae)蒿属的一年生草本植物，又名黄花蒿，植株高约30-150cm。1972年屠呦呦及其团队从青蒿中分离得到抗疟有效单体青蒿素(Artemisinin)。青蒿素是一种含有过氧桥结构的倍半萜内酯化合物，作为世界卫生组织(WHO)推荐的抗疟疾药物联合治疗(Artemisinin-basedcombinationtherapies，ACTs)的主要有效成分。近年来，青蒿素及其衍生物被报道具有治疗红斑狼疮、阿兹海默症、抗癌症和降血脂等功效。目前生产上的青蒿素主要来源于青蒿植株叶片的提取，然而青蒿中青蒿素的含量非常低，只占叶片干重的(0.1％-1％)，这使得这种药物的大规模商业化生产受到了极大限制。青蒿素的生物合成由细胞质的MVA途径和质体的MEP途径组成。青蒿素的生物合成由四个酶催化，既ADS(紫穗槐-4,11-二烯合酶)、CYP71AV1(细胞色素P450单加氧酶)、DBR2(青蒿醛双键还原酶)和ALDH1(二氢青蒿醛△11(13)还原酶)。值得注意的是中间前体物质青蒿醛既可以被DBR2催化形成二氢青蒿醛而最终形成青蒿酸，也可以被ALDH1和CYP71AV1催化形成青蒿酸而最终形成青蒿素B。因此青蒿醛是否可以有效地被DBR2催化形成二氢青蒿醛是得到高含量的青蒿素的关键，即DBR2酶的活性十分重要。AaTCP15是从青蒿中分离得到的一个TCP家族的转录因子，该家族具有典型的螺旋-环-螺旋(bHLH)结构。在拟南芥中，TCP3可以通过与MYB互作来调控黄酮合成，TCP15通过高光强来调控花青素的积累。在青蒿植株中提高或者抑制AaTCP15可以有效增加或者降低青蒿中青蒿素及二氢青蒿酸的含量，表明该基因在青蒿素生物合成途径中具有重要的调节作用。AaTCP15在不同组织部位和叶序中的表达模式与青蒿素合成途径中腺毛特异性表达的合成酶基因ADS、CYP71AV1、DBR2和ALDH1均具有较高的相似性。因此，该基因的启动子也极有可能在腺毛中优势表达。此基因还可特异结合并且激活DBR2和ALDH1启动子，从而激活青蒿素合成代谢通路，并且推动代谢流流向青蒿醛转化为二轻青蒿醛方向，最终提高青蒿素的含量。由于青蒿素是在分泌型腺毛中合成，因此克隆腺毛优势表达启动子对青蒿素代谢工程具有十分重要的意义。青蒿的叶片、花蕾和茎秆组织表面有两种腺毛。一种是多细胞结构的分泌型腺毛(glandularsecretorytrichomes,GSTs)，另一种是T型的非分泌型腺毛(T-shapetrichomes,TSTs)。植物腺毛在抵抗昆虫、传播花粉、降低紫外线伤害、减少蒸腾等方面都起到至关重要的作用。启动子是位于结构基因5′端上游的特定核酸序列，与RNA聚合酶特异识别。启动子能够调控下游基因表达的起始和表达程度。启动子像“开关”，通过顺式作用元件和反式作用因子(转录因子)的相互作用来发挥其特定的功能。启动子一共分三种：组成型启动子、特异型启动子、诱导型启动子。在目前青蒿的基因工程研究中，多采用组成型启动子，例如花椰菜花叶病毒35S启动子(CaMV35S)，这种启动子能够驱动外源基因在所有的组织和器官中表达，会过度消耗细胞内的物质和能量，并且不能在时间和空间上调控目的基因的表达，极可能会对植物的正常生长造成一定的负担和危害。因此急需找到在植物的组织器官中特异性表达的启动子来代替组成型启动子，从而更好的对植物基因的表达进行调控。由于以腺毛特异表达的启动子对于植物的腺毛系统进行遗传操作，不会对植物的生长发育造成危害，可以克服组成型启动子的种种弊端。因此，克隆AaTCP15基因的启动子对利用植物腺毛组织表达和生产代谢产物的基因工程育种具有重要意义。克隆其启动子将为研究AaTCP15基因的表达调控和分析启动子上的顺式作用元件奠定基础。
技术实现思路
本专利技术针对现有植物基因工程技术的不足，提出一种植物生物
的基因启动子，提供了深入研究分泌型和非分泌型腺毛的发生和发育以及其中的次级代谢产物的代谢调控的渠道，在利用植物腺毛组织表达和生产代谢产物的基因工程育种过程中，本专利技术提供的启动子能够优势在腺毛组织启动并高效表达外源基因，而且不会对植物的生长发育造成危害。本专利技术是通过以下技术方案实现的：本专利技术涉及一种调控基因在植物腺毛中表达的启动子，所述启动子为萜类合成酶基因启动子，所述启动子的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示。本专利技术涉及一种AaTCP15基因启动子在利用植物腺毛组织表达和生产代谢产物的基因工程育种中的应用，能够代替组成型启动子引导外源基因在植物分泌型和非分泌型腺毛中特异表达。本专利技术涉及的AaTCP15基因启动子的获得步骤具体如下：步骤一，培养青蒿无菌苗；步骤二，用PCR(PolymeraseChainReaction)法克隆启动子基因组序列；步骤三，分析启动子上的顺式作用元件，确定AaTCP15基因启动子的类型；步骤四，AaTCP15基因启动子连入pCAMBIA-1391z载体；步骤五，将构建好的载体pCAMBIA-1391z-AaTCP15载体转化根癌农杆菌；步骤六，将带有pCAMBIA-1391z-AaTCP15载体的根癌农杆菌转化青蒿；步骤七，PCR检测转基因植株；步骤八，启动子所引导的gus报告基因在植株中的表达部位的确定。技术效果与现有技术相比，本专利技术AaTCP15基因启动子可用于构建在分子生物学中融合外源目的基因，在分泌型和非分泌型腺毛组织中启动并高效表达，能广泛应用于利用植物腺毛组织表达和生产代谢产物的基因工程育种中。附图说明图1为转基因青蒿植株的PCR阳性检测，泳道1：DNAmarker2000；泳道2：阳性质粒对照；泳道3：非转基因青蒿对照；泳道4～12：pCAMBIA-1391z-AaTCP15转基因青蒿的9个不同株系；图2为利用AaTCP15基因启动子与GUS基因融合的载体pCAMBIA-1391z-AaTCP15转化青蒿后，所获得的转基因青蒿中的GUS组织染色图，主要分布于幼嫩叶片的分泌型和非分泌型腺毛中。具体实施方式下述实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆：实验室手册见NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress的1989年版中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。本实施例涉及的根癌农杆菌EHA105已在《黄亚丽，蒋细良，田云龙，郭萍，朱昌雄；根癌农杆菌介导的哈茨木霉菌遗传转化的研究，中国生物工程杂志，2008，28(3)：38-43》文献中公开。根癌农杆菌EHA105,质粒pCAMBIA-1391z可通过公开市售的商业渠道取得，如可以从澳大利亚CAMBIA公司购得，菌株编号为Gambar1。本实施例涉及AaTCP15基因启动子的获得，具体包括如下步骤：步骤一，培养青蒿无菌苗青蒿种子用体积分数为75％的乙醇浸泡3min，无菌水冲洗1次，再用25％(w/v)的NaClO浸泡20min后，无菌水冲洗3次～4次，用无菌吸本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种调控基因在植物腺毛中表达的启动子，其特征在于，所述启动子为萜类合成酶基因启动子，所述启动子的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
【技术特征摘要】
1.一种调控基因在植物腺毛中表达的启动子，其特征在于，所述启动子为萜类合成酶基因启动子，所述启动子的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示。2.根据权利要求1所述的启动子，其特征是，所述的启动子为诱导型启动子。3.根据权利要求1所述的启动子在植物分泌型和非分泌型腺毛组织表达和生产代谢产物的基因工程育种中的应用。4.一种调控基因在植物腺毛中表达的启动子的用途，其特征在于，所述启动子为特异型启动子，能够代替组成型启动子引导外源基因在植物分泌型和非分泌型腺毛中特异表达。5.一种载体，其特征在于，其连接有如权利要求1所述的调控基因在分泌型和非分泌型腺毛中表达的启动子。6.一种调控基因在植物腺毛中表达的启动子的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一，培养青蒿无菌苗；步骤二，通过PCR克隆启动子基因组序列；步骤三，分析启动子上的顺式作用元件，确定AaTCP15基因启动子的类型；步骤四，AaTCP15基因启动子连入pCAMBIA-1391z载体；步骤五，将构建好的载体pCAMBIA-1391z-AaTCP15载体转化根癌农杆菌；步骤六，将带有pCAMBIA-1391z-AaTCP15载体的根癌农杆菌转化青蒿；步骤七，PCR检测转基因植株；步骤八，启动子所引导的gus报告基因在植株中的表达部位的确定。7.根据权利要求5所述的方法，其特征是，采用两轮巢式PCR(NestedPCR)扩增分泌型和非分泌型腺毛优势表达...
【专利技术属性】
技术研发人员：唐克轩，马亚男，徐东北，付雪晴，沈乾，石璞，黎凌，陈明慧，谢利辉，孙小芬，
申请(专利权)人：苏州唐基生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32
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