本发明专利技术公开了一种耐受高浓度乙酸的运动发酵单胞菌突变株及其应用，菌株分类学命名为运动发酵单胞菌AQ8‑1，保藏号为GDMCC60258；和运动发酵单胞菌AQ8‑9，保藏号为GDMCC60259。诱变筛选步骤为：1)常温等离子体诱变；2)培养基恢复培养；3)高乙酸浓度下反复筛选得到菌株；本发明专利技术的运动发酵单胞菌突变株可以在含有5.0‑8.0g/L的乙酸的培养液迅速生长，并进行乙醇发酵；本发明专利技术还提供了一种乙醇发酵的方法。
A mutant strain of monomonas Aeromonas with high concentration of acetic acid and its application
The invention discloses a high concentration of acetic acid tolerance of Zymomonas mutant strain and its application, taxonomy named Zymomonas AQ8 1, the preservation number is GDMCC60258; and Zymomonas AQ8 9, the preservation number is GDMCC60259. Mutagenesis and screening steps are as follows: 1) normal plasma mutagenesis; 2) medium recovery training; 3) high concentration of acetic acid under screened strains; culture liquid of the invention of Zymomonas mutants in acetic acid containing 5 8.0g/L rapid growth, and ethanol fermentation; the invention also provides a method of ethanol fermentation.
【技术实现步骤摘要】
一种耐受高浓度乙酸的运动发酵单胞菌突变株及其应用
本专利技术属于微生物领域，具体涉及一种耐受高浓度乙酸的运动发酵单胞菌突变株及其应用，可应用于纤维素预处理和水解液、餐厨垃圾发酵体系等含有乙酸的发酵环境中生产燃料乙醇生物基产品的用途。
技术介绍
大力发展可再生能源已经成为全球应对气候变化、能源安全等全球性重大问题的共识，而纤维素乙醇作为一种可再生能源已经受到重视。然而破除木质纤维素抗降解屏障是纤维素转化为燃料乙醇的首要障碍。目前广为应用的热化学预处理等手段均会产生乙酸等副产物，重者会严重阻碍乙醇发酵过程。随着环保理念的深入人心，餐厨垃圾发酵成为新的能源来源，但餐厨垃圾餐厨垃圾是一种成分较为复杂的原料，在乙醇发酵的过程中产生乙酸等副产物，也会阻碍发酵过程的产生。利用额外的脱毒工艺会增加生产成本。相比较而言，利用生物手段构建耐受乙酸的优良微生物菌株将是抵御乙酸毒害、降低生产成本的方法之一。运动发酵单胞菌(Zymomonasmobislis)是产乙醇的优良物种，近年来在可再生燃料乙醇研究和生产中受到广泛关注，杜邦公司已经开发出利用该菌进行燃料乙醇生产的工艺生产线。然而目前在运动发酵单胞菌进行木质纤维素燃料乙醇发酵工艺中，高浓度的乙酸对于乙醇发酵工艺仍然是一个巨大的挑战。因此找到一种新的可以在高浓度乙酸下生长的运动发酵单胞菌菌株是亟待解决的问题。
技术实现思路
针对现有技术的不足，本专利技术在于提出一种耐受高浓度乙酸的运动发酵单胞菌突变株及其应用。本专利技术提供了一种耐受高浓度乙酸的运动发酵单胞菌突变株，菌株分类学命名为运动发酵单胞菌AQ8-1，保藏号为：GDMCC60258；运动发酵单胞菌AQ8-9，保藏号为GDMCC60259，均于2017年11月1日保藏在广东省微生物菌种保藏中心。本专利技术还提供了筛选耐受高浓度乙酸的运动发酵单胞菌突变株的方法，为了达到上述的目的，本专利技术所采用的技术方案是：1)通过常温等离子体诱变育种技术对运动发酵单胞菌菌体进行辐照诱变，首先将出发菌株ZM4进行活化培养，培养温度为30℃，培养时间为16h；2)然后取过夜培养物(106～108个细胞)，4℃下离心5～10min，转速为3000rpm，用生理盐水洗菌体并重悬于1mL生理盐水中；取10μL重悬细胞置于ARTP诱变育种仪诱变15～150s；3)辐照诱变后的细胞重悬恢复培养16h，再涂布在含5-8g/L乙酸的固体培养基上培养；4)挑选所有菌落在含有8g/L乙酸的培养基上进行筛选，重复至少三次。具体的，步骤2)中等离子载气纯度为99.999％，气体流量为10～20标准气流量，电压100～120V，等离子体辐照温度22℃；具体的，步骤3)和步骤4)中固体培养基包含50g/L葡萄糖、2g/L磷酸二氢钾、10g/L酵母提取物、5-8g/L乙酸。本专利技术还提供了如上所述的运动发酵单胞菌在含有乙酸的环境中高效生产乙醇的用途，具体涉及纤维素预处理和水解液、餐厨垃圾发酵体系等含有乙酸的发酵环境中生产燃料乙醇生物基产品的用途。为了达到以上目的，所采用的技术方案包括以下步骤：(1)配制发酵培养基；(2)向所述的发酵培养基上接种发酵菌株，进行发酵培养；(3)分离发酵体系中的乙醇。具体的，发酵生产乙醇的发酵过程的全部或者部分在不低于5.0-8.0g/L的乙酸浓度下进行。具体的，发酵培养基的配方包括：20-50g/L葡萄糖，2g/L磷酸二氢钾，10g/L酵母提取物和5-8g/L乙酸；具体的，发酵菌株为运动发酵单胞菌AQ8-1和AQ8-9中的一种或两种；具体的，接种发酵菌株的接种量为10％，发酵时间为20～60h。本专利技术的有益效果是：经等离子体诱变筛选得到的两株突变菌株可以在高浓度乙酸环境下具有良好生长性能，在同样高乙酸浓度下，突变菌株的乙醇转化率可用于纤维素预处理和水解液、餐厨垃圾发酵体系等含有乙酸的发酵环境中快速高效生产乙醇。生物材料保藏本专利技术的耐受高浓度乙酸的运动发酵单胞菌由保藏编号为CICC41465的运动发酵单胞菌ZM4经等离子体诱变和筛选得到。该菌株分类命名为运动发酵单胞菌(Zymomnasmobilis)AQ8-1，保藏号为：GDMCC60258；和运动发酵单胞菌AQ8-9，保藏号为：GDMCC60259。保藏日期均为2017年11月1日，保藏单位为广东省微生物菌种保藏中心，地址位于广州市先烈中路100号微生物所实验楼三楼。具体实施方式下面列举实施例对本专利技术进行进一步说明，但并不因此限制本专利技术的内容。本实施例中出发菌株为运动发酵单胞菌ZM4菌株，购自中国工业微生物菌种保藏中心，现编号为CICC41465。实施例1本实施例说明将ZM4作为出发菌株诱变筛选得到运动发酵单胞菌AQ8-1、AQ8-9的方法：1)通过常温等离子体诱变育种技术对运动发酵单胞菌菌体进行辐照诱变，首先将出发菌株ZM4于30℃下活化培养16h，然后取过夜培养物(107至108个细胞)，4℃下离心5min，转速为3000rpm，用生理盐水洗菌体并重悬于1mL生理盐水中；取10μL重悬细胞置于ARTP诱变育种仪诱变120s；2)将已辐照诱变后的细胞重悬恢复培养16h，再涂布在含7g/L乙酸的固体培养基上培养；3)挑选所有菌落在含有8g/L乙酸的培养基上进行筛选，重复筛选三次后最终得到两株稳定突变菌株，将其命名为AQ8-1和AQ8-9。实施例2突变菌株发酵生产乙醇的方法1)发酵培养基的配制：50g/L葡萄糖、2g/L磷酸二氢钾、10g/L酵母提取物和7g/L乙酸，此时培养基的pH＝3.92(此pH值为添加7g/L乙酸自然达到的pH)2)在发酵培养基上接种菌株，进行发酵培养：分别将菌株AQ8-1、AQ8-9和出发菌株接种于培养基上，接种量为10％，发酵培养40-48h。3)分离乙醇，计算转化率。经过48h发酵培养后两株突变菌可将葡萄糖全部消耗完，且菌株AQ8-1和AQ8-9的乙醇转化率分别达到理论转化率的94％和98％，而此时出发菌株转化率仅为理论转化率的12％。实施例3突变菌株的发酵生产乙醇的方法1)发酵培养基的配制：50g/L葡萄糖、2g/L磷酸二氢钾、10g/L酵母提取物、8g/L乙酸，pH3.86(此pH值为添加8g/L乙酸自然达到的pH)2)在发酵培养基上接种菌株，进行发酵培养：分别将菌株AQ8-1、AQ8-9和出发菌株接种于培养基上，接种量均为10％，发酵培养60h。3)分离乙醇，计算转化率。经过60h后两株突变菌可将葡萄糖全部消耗完，且菌株AQ8-1和AQ8-9的乙醇转化率均可达到理论转化率的96，而此时出发菌株已经不能正常生长。实施例4突变菌株的发酵生产乙醇的方法1)发酵培养基的配制：20g/L葡萄糖，2g/L磷酸二氢钾、10g/L酵母提取物和7g/L乙酸，pH3.92(此pH值为添加7g/L乙酸自然达到的pH)2)在发酵培养基上接种菌株，进行发酵培养：分别将菌株AQ8-1、AQ8-9和出发菌株接种于培养基上，接种量为10％，发酵培养分别为50和60h。3)分离乙醇，计算转化率。分别经过50和60h后两株突变菌可将葡萄糖全部消耗完，且菌株AQ8-1和AQ8-9的乙醇转化率分别达到理论转化率的96％和84％。而出发菌株在此条件下不能生长。实施例5突变菌株的发酵生产乙醇的方法1)发酵本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种耐受高浓度乙酸的运动发酵单胞菌突变株，其特征在于，菌株分类学命名为运动发酵单胞菌AQ8‑1，保藏号为GDMCC 60258。
【技术特征摘要】
1.一种耐受高浓度乙酸的运动发酵单胞菌突变株，其特征在于，菌株分类学命名为运动发酵单胞菌AQ8-1，保藏号为GDMCC60258。2.一种耐受高浓度乙酸的运动发酵单胞菌突变株，其特征在于，菌株分类学命名为运动发酵单胞菌AQ8-9，保藏号为GDMCC60259。3.如权利要求1或2所述的一种耐受高浓度乙酸的运动发酵单胞菌突变株在含有乙酸的发酵环境中发酵生产乙醇的用途。4.如权利要求3所述的用途，其特征在于，所述的运动发酵单胞菌发酵生产乙醇的发酵原料包括：纤维素预处理和水解液、餐厨垃圾的至少一种。5.如权利要求3所述的用途，其特征在于，所述的运动发酵单胞菌发酵生产乙醇的发酵过程的全部或者部分在不低于5....
【专利技术属性】
技术研发人员：何明雄，吴波，秦晗，谭芙蓉，
申请(专利权)人：农业部沼气科学研究所，
类型：发明
国别省市：四川,51
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