一种耐受有机溶剂漆酶衍生物及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种耐受有机溶剂漆酶衍生物及其制备方法，该耐受有机溶剂漆酶衍生物的突变体为T480A和T480F；T480A的核苷酸序列为SEQ ID NO1；T480F的核苷酸序列为SEQ ID NO2；制备方法为：引物的设计、Dpn Ⅰ酶切消化、退火、纯化回收、转化、测序；将转化平板中的菌落送去测序验证，得到耐受有机溶剂漆酶衍生物的突变体T480A菌株和T480F菌株。本发明专利技术通过Dpn Ⅰ法构建突变体，最终获得CotA的突变体T480A和T480F。

An organic solvent laccase derivative and its preparation method

The invention discloses an organic solvent resistant laccase derivative and its preparation method, the organic solvent tolerance of laccase derivatives for T480A and T480F mutants; the nucleotide sequence of T480A SEQ ID NO1; the nucleotide sequence of T480F SEQ ID NO2; the preparation method is as follows: primer design, Dpn of enzyme digestion, annealing, purification and recovery and transformation, will be transformed in sequence; flat colonies sent to sequencing by laccase derivatives of organic solvent resistant mutant T480A strain and T480F strain. The present invention mutants by Dpn 1 method, finally obtained CotA mutants T480A and T480F.

【技术实现步骤摘要】
一种耐受有机溶剂漆酶衍生物及其制备方法
本专利技术属于医药学
，尤其涉及一种耐受有机溶剂漆酶衍生物及其制备方法。
技术介绍
漆酶(EC1.10.3.2)是一种多铜氧化酶，从底物吸收电子，传递给氧气生成水，具有环保和高效的特点。漆酶底物范围很广，包括邻苯二酚、对苯二酚、多酚、甲氧基替代酚、氮羟基化合物、苯胺和呈现还原性的有机化合物。因为环保高效且具有广泛的底物谱，漆酶在很多领域都有巨大的应用潜力，如生物修复、生物合成、生成检测和生物质能源等等。在漆酶催化的反应往往需要在有机介质中进行，一般来说,在有机介质中酶催化反应具有以下优点:(1)增加反应物的溶解度；(2)使反应平衡发生移动；(3)分离简单。然而，有机介质往往使漆酶的稳定性和活性较低，因此,需要对野生型漆酶进行改造，筛选耐受有机溶剂的漆酶突变体，
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种耐受有机溶剂漆酶衍生物及其制备方法，旨在解决有机介质使漆酶的稳定性和活性降低的问题。本专利技术是这样实现的，一种耐受有机溶剂漆酶衍生物，该耐受有机溶剂漆酶衍生物的突变体为T480A和T480F；所述T480A的核苷酸序列为SEQIDNO1；所述T480F的核苷酸序列为SEQIDNO2。本专利技术的另一目的在于提供一种所述耐受有机溶剂漆酶衍生物制备的漆酶。本专利技术的另一目的在于提供一种耐受有机溶剂漆酶衍生物的制备方法，其包括以下步骤：引物的设计：把待突变的氨基酸的核苷酸序列换成突变后的核苷酸序列，再加上突变位点前后各6个氨基酸的核苷酸序列组成正向引物，再把正向引物反向互补得到反向引物；T480A的正向引物核苷酸序列为SEQIDNO3；T480A的反向引物核苷酸序列为SEQIDNO4；T480F的正向引物核苷酸序列为SEQIDNO5；T480F的反向引物核苷酸序列为SEQIDNO6；DpnⅠ酶切消化：分别用正反向引物对pGEX6P-1-CotA质粒进行扩增，扩增条件:94度,5分钟；94度,1分钟；68度,30秒；72度,1分钟；循环30次；72度,5分钟；冷却到4度；退火：将酶切后产物混合，72℃反应10min后室温退火；纯化回收：将退火后的产物用试剂盒纯化回收；转化：将回收产物转化到感受态DH5α中；测序：将转化平板中的菌落送去测序验证，得到耐受有机溶剂漆酶衍生物的突变体T480A菌株和T480F菌株。进一步，得到耐受有机溶剂漆酶衍生物的突变体T480A菌株和T480F菌株后还需进行突变体蛋白的纯化；突变体蛋白的纯化方法包括：(1)离心收集过夜诱导的菌体，重悬浮于50mMNaCl,25mMTris-HClpH8.0的Buffer中，超声破碎；(3)将破碎后的菌体12000rpm离心30min，将上清液进行GST亲和层析，并在亲和柱中加入PPase过夜酶切，以去除融合蛋白中的GST标签；(4)将PPase酶切后的突变体蛋白进行ResourceQ和MonoQ的离子交换纯化。进一步，所述突变体蛋白的纯化前需进行蛋白的培养；蛋白的培养方法包括：1)将保存在-80℃的突变体菌株划线到LB固体平板中，37℃过夜活化；2)从活化好的固体平板中挑起单菌落于10ml有氨苄抗性的液体LB培养基中，37℃、200rpm过夜活化做种子液；3)按0.5％的接种量将种子液接种于1L有氨苄抗性的液体LB培养基中，37℃、200rpm培养；4)当OD600为0.6时，加入IPTG使终浓度为0.2mM，加入硫酸铜使终浓度为0.25mM，18℃、180rpm过夜诱导。本专利技术提供的耐受有机溶剂漆酶衍生物及其制备方法，通过DpnⅠ法构建突变体，最终获得CotA的突变体T480A和T480F。CotA、T480A和T480F在乙醇、甲醇、乙腈和DMSO这四种有机溶剂中对底物ABTS的酶活，有三个趋势：第一，在水溶液条件下，T480A的酶活比野生型蛋白提高60％；第二，在30％的乙醇溶液中，T480A仍能保持比野生型在水溶液中的活性高19％的水平，而野生型蛋白活性则降低了18％；第三，在40％的甲醇溶液中，T480A仍能保持相当于野生型在水溶液中的活性水平，而野生型蛋白活性则降低了32％；第三，在30％的乙腈溶液中，T480A仍能保持相当于野生型在水溶液中71％的活性，而野生型蛋白活性则只有水溶液中活性的46％。第四，在20％的DMSO溶液中，T480A仍能保持相当于野生型在水溶液中的活性水平，而野生型蛋白活性则只有水溶液中活性的68％。本专利技术利用定点突变，得到了突变体T480A和T480F，T480A在30％的乙醇溶液中，仍能保持相当于野生型在水溶液中的活性水平，T480A在40％的甲醇溶液中，仍能保持相当于野生型在水溶液中的活性水平，为T480A应用于工业生产中奠定了基础。附图说明图1是本专利技术实施例提供的耐受有机溶剂漆酶衍生物制备方法流程图。图2是本专利技术实施例提供的CotAWT、T480A和T480F在乙醇中对底物ABTS的酶活图；图3是本专利技术实施例提供的CotAWT、T480A和T480F在甲醇中对底物ABTS的酶活图；图4是本专利技术实施例提供的CotAWT、T480A和T480F在乙腈中对底物ABTS的酶活图；图5是本专利技术实施例提供的CotAWT、T480A和T480F在DMSO中对底物ABTS的酶活图。图6是本专利技术实施例提供的野生型CotA及其突变体(T480A和T480F)纯化后的SDS-PAGE电泳示意图。具体实施方式为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本专利技术进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。下面结合附图对本专利技术的应用原理作进一步描述。本专利技术实施例提供的耐受有机溶剂漆酶衍生物，该耐受有机溶剂漆酶衍生物的突变体为T480A和T480F；所述T480A的核苷酸序列为SEQIDNO1；所述T480F的核苷酸序列为SEQIDNO2。如图1所示，本专利技术实施例提供的耐受有机溶剂漆酶衍生物制备方法，包括以下步骤：S101：引物的设计：把待突变的氨基酸的核苷酸序列换成突变后的核苷酸序列，再加上突变位点前后各6个氨基酸的核苷酸序列组成正向引物，再把正向引物反向互补得到反向引物；T480A的正向引物核苷酸序列为SEQIDNO3；T480A的反向引物核苷酸序列为SEQIDNO4；T480F的正向引物核苷酸序列为SEQIDNO5；T480F的反向引物核苷酸序列为SEQIDNO6；S102：DpnⅠ酶切消化：分别用正反向引物对pGEX6P-1-CotA质粒进行扩增，并将得到的产物用DpnⅠ酶在37℃下酶切5h；S103：退火：将酶切后产物混合，72℃反应10min后室温退火；S104：纯化回收：将退火后的产物用试剂盒纯化回收；S105：转化：将回收产物转化到感受态DH5α中；S106：测序：将转化平板中的菌落送去测序验证，得到耐受有机溶剂漆酶衍生物的突变体T480A菌株和T480F菌株。所述S101中，SEQIDNO3为：5’-GTCCTGAGAATCGCGGCGGCATTCGGTCCGTACAGCGGAC-3’；SEQIDNO4为：5’-GTCCGCTGTACGGACCGAATGCCGCCGCGATTCTCAGGAC-3’；SEQID本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种耐受有机溶剂漆酶衍生物，其特征在于，该耐受有机溶剂漆酶衍生物的突变体为T480A和T480F；所述T480A的核苷酸序列为SEQ ID NO1；所述T480F的核苷酸序列为SEQ ID NO2。

【技术特征摘要】
1.一种耐受有机溶剂漆酶衍生物，其特征在于，该耐受有机溶剂漆酶衍生物的突变体为T480A和T480F；所述T480A的核苷酸序列为SEQIDNO1；所述T480F的核苷酸序列为SEQIDNO2。2.一种由权利要求1所述耐受有机溶剂漆酶衍生物制备的漆酶。3.一种如权利要求1所述的耐受有机溶剂漆酶衍生物的制备方法，其特征在于，该耐受有机溶剂漆酶衍生物的制备方法包括以下步骤：引物的设计：把待突变的氨基酸的核苷酸序列换成突变后的核苷酸序列，再加上突变位点前后各6个氨基酸的核苷酸序列组成正向引物，再把正向引物反向互补得到反向引物；T480A的正向引物核苷酸序列为SEQIDNO3；T480A的反向引物核苷酸序列为SEQIDNO4；T480F的正向引物核苷酸序列为SEQIDNO5；T480F的反向引物核苷酸序列为SEQIDNO6；DpnⅠ酶切消化：分别用正反向引物对pGEX6P-1-CotA质粒进行扩增，扩增条件:94度,5分钟；94度,1分钟；68度,30秒；72度,1分钟；循环30次；72度,5分钟；冷却到4度；将得到的产物用DpnⅠ酶在37℃下酶切5h；退火：将酶切后产物混合，72℃反应10min后室温退火；纯化回收：将退火后的产物用试剂盒纯化回收；转化：将回收产物转化到感受态DH5α中；测序：将转化平板中的菌落送去测序验证...

【专利技术属性】
技术研发人员：王刚刚，
申请(专利权)人：常熟市中科兴华生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32