用于生成分化祖细胞的改进方法，包括由胚泡获得内细胞团细胞，并诱导内细胞团细胞分化产生分化祖细胞。可以转染分化祖细胞，从而添加、删除、或改变期望基因。分化祖细胞可用于细胞疗法和作为生成移植用的组织和器官的细胞来源。还提供了用于生成谱系缺陷型人胚胎干细胞的方法。（*该技术在2020年保护过期，可自由使用*）
【技术实现步骤摘要】
技术介绍
专利
本专利技术涉及使桑椹胚细胞或胚泡内细胞分化的方法。这些细胞可用于细胞疗法和用于生成等基因、同种异体、和/或异种移植用的细胞和器官。本专利技术还涉及生成谱系缺陷型胚胎干细胞，它们不会分化成特定分化谱系，诸如中胚层、内胚层、或外胚层。相关技术的描述用于在体外由早期前植入小鼠胚胎衍生胚胎干(ES)细胞系的方法是众所周知的(参阅例如Evans等人，Nature，29154-156，1981；Martin，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，787634-7638，1981)。若存在成纤维细胞饲养层(Evans等人，同上)或分化抑制源(Smith等人，Dev.Biol.，1211-9，1987)，则能够将ES细胞以未分化状态进行传代。先前已经报导了ES细胞具有许多应用。例如，已经报导了ES细胞可作为分化的体外模型，尤其是用于研究涉及调控早期发育的基因。在导入前植入小鼠胚胎后，小鼠ES细胞能够引起种系嵌合体，由此证明它们的多能性(Bradley等人，Nature，309255-256，1984)。考虑到它们将它们的基因组转移给下一代的能力，通过使用含或不含期望遗传修饰的ES细胞，ES细胞具有家畜动物种系操作的潜在效用。此外，在家畜动物(如有蹄类)的情况中，来自像前植入家畜胚胎的细胞核支持去核卵母细胞发育至分娩期(Smith等人，Biol.Reprod.，401027-1035，1989；Keefer等人，Biol.Reprod.，50935-939，1994)。这与来自超过八细胞阶段的小鼠胚胎的细胞核相反，据报导后者在移植后不支持去核卵母细胞的发育(Cheong等人，Biol.Reprod.，48958，1993)。因此，来自家畜动物的ES细胞非常有价值，因为它们可以为核移植流程提供全能供体细胞核的潜在来源(可以经过或未经过遗传修饰)。有些研究小组已经报导了据说多能的胚性细胞系的分离。例如，Notarianni等人，J.Reprod.Fert.Suppl.，43255-260，1991报导了由猪和绵羊胚泡建立据说稳定且多能的细胞系，它们展示的一些形态学和生长特征与通过免疫手术由绵羊胚泡分离的内细胞团的原代培养细胞相似。同样，Notarianni等人，J.Reprod.Fert.Suppl.，4151-56，1990公开了来自猪胚泡的推定多能的胚细胞系在培养中的维持和分化。Gerfen等人，Anim.Biotech.，6(1)1-14，1995公开了由猪胚泡分离胚细胞系。在小鼠胚成纤维细胞饲养层中可稳定维持这些细胞而不使用条件培养基，而且据报导在培养过程中分化成几种不同的细胞类型。此外，Saito等人，Roux’s Arch.Dev.Biol.，201134-141，1992报导了存活3代但在第4代后丧失的培养牛胚胎干细胞样细胞系。Handyside等人，Roux’s Arch.Dev.Biol.，196185-190，1987公开了通过免疫手术分离的绵羊胚胎内细胞团在能够分离由小鼠内细胞团衍生的小鼠ES细胞系的条件下培养。Handyside等人报导了在这种条件下，绵羊内细胞团贴壁、扩展、并发展ES细胞样细胞和内胚层样细胞两种区域，但是在延长培养后只有内胚层样细胞是明显的。最近，Cherny等人，Theriogenology，41175，1994报导了在长期培养中维持的据说多能的牛原始生殖细胞衍生细胞系。这些细胞在培养大约7天后生成ES样集落，碱性磷酸酶(AP)染色阳性，展示形成胚状体的能力，并自发分化成至少两种不同的细胞类型。据报导这些细胞还表达转录因子OCT4、OCT6、和HES1的mRNA，这是认为唯独由ES细胞表达的同源异型框基因模式。同样在最近，Campbell等人，Nature，38064-68，1996报导了在对培养胚盘(ED)细胞(来自在促进在小鼠中分离ES细胞系的条件下培养9天的绵羊胚胎)进行核移植之后生成了活的小羊。作者得出结论，来自第9天的绵羊胚胎的ED细胞通过核移植实现全能，而且全能性在培养中得到维持。Van Stekelenburg-Hamers等人，Mol.Reprod.Dev，40444-454，1995报导了来自牛胚泡内细胞团细胞的据说永久的细胞系的分离和鉴定。作者在不同条件下由第8或9天的牛胚泡分离并培养内细胞团，以确定哪种饲养细胞和培养培养基对支持牛内细胞团细胞的贴壁和扩展最有效。他们得出结论，培养内细胞团细胞的贴壁和扩展通过STO(小鼠成纤维细胞)饲养细胞(代替牛子宫上皮细胞)的使用和通过在培养培养基中添加经木炭吸收过的血清(而非普通血清)而得到增强。然而，Van Stekelenburg等人报导了他们的细胞系更像上皮细胞而非多能内细胞团细胞。Smith等人，WO94/24274，发表于1994年10月27日；Evans等人，WO90/03432，发表于1990年4月5日；和Wheeler等人，WO94/26889，发表于1994年11月24日，报导了据说可用于获得转基因动物的动物干细胞的分离、选择、和增殖。Evans等人还报导了由猪和牛物种衍生的据说多能的胚胎干细胞，据说可用于生成转基因动物。另外，Wheeler等人，WO94/26884，发表于1994年11月24日，公开了据说可用于生成嵌合和转基因有蹄类的胚胎干细胞。因而，根据上文，例如由于ES细胞系在生成克隆或转基因胚胎中和在核移植中的潜在应用，显然许多小组已经试图生成ES细胞系。还已经有报导了将有蹄类内细胞团(ICM)细胞用于核移植的应用。例如，Collas等人，Mol.Reprod.Dev.，38264-267，1994公开了将经裂解供体细胞显微注射到去核成熟卵母细胞中而进行的牛ICM核移植。Collas等人公开了将胚胎在体外培养7天而生成15个胚泡，在将其移植到牛受体中后导致4次怀孕和2次出生。同样，Keefer等人，Biol.Reprod.，50935-939，1994公开了牛ICM细胞在核移植流程中作为供体细胞核用于生成胚泡的应用，在将胚泡移植到牛受体中后生成数个活的子代。此外，Sims等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，906143-6147，1993公开了将细胞核由短期体外培养的牛ICM细胞移植到去核成熟卵母细胞中而生成小牛。还已经报导了在对培养胚盘细胞进行核移植后生成活的小羊(Campbell等人，Nature，38064-68，1996)。还有，已经报导了牛多能胚性细胞在核移植和生成嵌合胎儿中的应用(Stice等人，Biol.Reprod.，54100-110，1996；Collas等人，Mol.Reprod.Dev.，38264-267，1994)。Collas等人证明了颗粒细胞(成熟细胞)可用于牛克隆流程以生成胚胎。然而，没有证明发育超过了早期胚胎阶段(胚泡阶段)。同样，颗粒细胞不容易培养，而且只能由雌兽获得。Collas等人没有尝试在培养物中增殖颗粒细胞或者遗传修饰那些细胞。Thomson，美国专利号5,843,780，1998年12月1日颁发，报导了灵长类胚胎干细胞的纯化。据报导，在这些细胞中，细胞表面标记SSEA-1呈阴性，细胞表面标记SSEA本文档来自技高网...
【技术保护点】
用于生成分化祖细胞的方法，包括：（Ⅰ） 获得桑椹胚衍生细胞或胚泡的内细胞团细胞；并（Ⅱ） 诱导桑椹胚衍生细胞或内细胞团细胞分化成分化祖细胞。
【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：J西贝里，MD维斯特，RP兰扎，
申请(专利权)人：先进细胞技术公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]
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