奈瑟球菌蛋白质的杂交表达制造技术

以单个杂交蛋白形式表达两种或多种奈瑟球菌的蛋白质（如Ａ和Ｂ），其可以式ＮＨ＃－［２］－Ａ－Ｂ－ＣＯＯＨ简单地表示。（*该技术在2021年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及蛋白质表达的领域。具体说，本专利技术涉及奈瑟球菌(如淋病奈瑟球菌或较佳地为脑膜炎奈瑟球菌)的蛋白质的异源表达。
技术介绍
国际专利申请WO 99/24578、WO99/36544、WO99/57280和WO 00/22430公开了脑膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)和淋病奈瑟球菌(Neisseriagonorrhoeae)的蛋白质。这些蛋白质一般是以N-未端GST-融合体或C-未端His-标记融合体在大肠杆菌中表达的(即异源表达)，虽然也公开了其它表达系统(包括在天然的奈瑟球菌中的表达)。本专利技术的目的是提供这些蛋白质的异源表达的其它或改进方法。这些方法通常影响表达的水平、纯化的简易程度、表达的细胞内定位和/或表达的蛋白质的免疫学特性。专利技术的公开在本专利技术中，以单杂交蛋白表达本专利技术的两种或多种(如3、4、5、6或更多)蛋白质。较佳地，不使用非奈瑟球菌的融合配体(如GST或聚-His)。这有两个优点。其一，可能不稳定或本身表达很差的蛋白质可以通过加入合适的克服该问题的杂交配体予以帮助。其二，简化工业生产，即制备两种分别有用的蛋白质只需要一次表达和纯化。因此，本专利技术提供了同时异源表达本专利技术的两种或多种蛋白质的方法，其中所述的本专利技术的两种或多种蛋白质是融合的(即，它们是作为单多肽链翻译的)。该方法通常包括如下步骤获得编码本专利技术第一种蛋白质的第一核酸；获得编码本专利技术第二种蛋白质的第二核酸；连接第一和第二核酸。将得到的核酸插入表达载体中，或已作为表达载体的一部分。当仅连接两种蛋白质时，可以式NH2-A-B-COOH简单地表示杂交蛋白。A和B各选自任何奈瑟球菌蛋白质，尤其是那些以SEQ#1-4326表示的。该方法非常适合表达蛋白质orf1、orf4、orf25、orf40、Orf46/46.1、orf83、233、287、292L、564、687、741、907、919、953、961和983。由式NH2-A-B-COOH在下表中以‘X′表示的42个杂交体是优选的 因此，优选的以杂交体表达的蛋白质是ORF46.1,287,741,919,953,961和983。它们可以全长形式或多-甘氨酸缺失(△G)形式使用(如△G-287、△GTbp2、△G741、△G983等)、或以截短形式使用(如△1-287、△2-287等)，或以结构域缺失的形式使用(如287B、287C、287BC、ORF461-433、ORF46433-608、ORF46、961c等)等。特别优选的是(a)含919和287的杂交蛋白；(b)含953和287的杂交蛋白；(c)含287和ORF46.1的杂交蛋白；(d)含ORF1和ORF46.1的杂交蛋白；(e)含919和ORF46.1的杂交蛋白；(f)含ORF46.1和919的杂交蛋白；(g)含ORF46.1、287和919的杂交蛋白；(h)含919和519的杂交蛋白；和(i)含ORF97和225的杂交蛋白。附图中显示了其它优选例，它们包括△G287-919、△G287-953、△G287-961、△G983-ORF46.1、△G983-741、△G983-961、△G983-961C、△G741-961、△G741-961C、△G741-983、△G741-ORF46.1、ORF46.1-741、ORF46.1-961、ORF46.1-961C、961-ORF46.1、961-741、961-983、961C-ORF46.1、961C-741、961C-983、961CL-ORF46.1、961CL-741和961CL-983。当使用287时，其优先位于杂交体的C-未端；如果在N-未端使用它，则优先使用287的△G形式(如与ORF46.1、919、953或961杂交的杂交体的N-未端)。当使用287时，其优先为菌株2996或菌株394/98的。当使用961时，其优先在N-未端。可使用961的结构域形式。WO 99/66741公开了ORF46、287、919和953的多态形式的排序。本专利技术可以使用这些多态形式中的任一形式。较佳地，本专利技术杂交蛋白中的组成蛋白质(A和B)来源于是同一菌株。杂交体中的融合蛋白可以是直接相连的，或者是通过接头肽相连的，如通过聚-甘氨酸接头(即，Gn，其中n＝3、4、5、6、7、8、9、10或更多)或通过协助克隆的短肽序列相连。显然不宜将△G蛋白质连接于聚-甘氨酸接头的C-未端。融合蛋白可以缺失天然前导肽或可以包含N-未端融合配体的前导肽序列。宿主较佳地，利用异源宿主。异源宿主可以是原核的或真核的。优先为大肠杆菌，但其它合适的宿主包括枯草芽孢杆菌(Bacillus sudtilis)、霍乱弧菌(Vibriocholerae)、伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)、鼠伤寒沙门氏菌(salmonellatyphimurium)、脑膜炎奈瑟球菌、淋病奈瑟球菌、乳糖奈瑟球菌(Neisserialactamica)、灰色奈瑟球菌(Neisseria cinerea)、分枝杆菌(如结核分枝杆菌(M.tuberculosis)、酵母等。载体、宿主等如上所述的方法，本专利技术提供了(a)用于这些方法的核酸和载体；(b)含所述载体的宿主细胞；(c)可用这些方法表达的或可表达的蛋白质；(d)包含这些蛋白质的组合物，其可能适合作为疫苗、或例如诊断剂或免疫原性的组合物；(e)用作药物(如疫苗)或诊断剂的组合物；(f)这些组合物在制备以下物质中的用途(1)用于治疗或预防奈瑟球菌引起的感染的药物(2)检测奈瑟球菌或由奈瑟球菌引起的抗体存在与否的诊断剂，和/或(3)能产生抗奈瑟球菌抗体的药物；和(g)治疗患者的方法，其包括对该患者施用治疗有效量的这些组合物。序列本专利技术还提供了具有以下实施例中所列出的任何的蛋白质或核酸。本专利技术还提供了具有与这些序列是序列相同性的蛋白质和核酸。如上所述，“序列相同性”的程度最好大于50％(如60％、70％、80％、90％、95％、99％或更大)。本文的命名本文参考在WO 99/24578、WO 99/36544和WO 99/57280中公开的2166个蛋白质序列，并将它们编号为如下的SEQ# 除了这种SEQ#编号外，本文还使用了WO 99/24578、WO 99/36544和WO99/27280中的命名约定(如WO99/24578和WO 99/36544中用的‘ORF4′、‘ORF40′、‘OFR40-1′等；WO 99/57280中用的‘m919′、‘g919′和‘a919′等)。在本文中将Tettelin等中的从NMB0001到NMB2160的2160个蛋白质称为SEQ#2167-4326。本文采用的术语“本专利技术的蛋白质”指包含以下的蛋白质(a)SEQ#1-4326中的一个序列；或(b)与SEQ#1-4326中的一个序列相同的序列；或(c)SEQ#1-4326中的一个序列的片段。(b)中的“序列相同性”的程度最好大于50％(如60％、70％、80％、90％、95％、99％或更大)。其包括突变体和等位基因变体。相同性最好用Smith-Waterman同源性搜寻算法确定，如在MPSRCH程序(Oxf本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种同时异源表达本专利技术两种或多种蛋白质的方法，其特征在于，所述的方法中（ａ）所述的本专利技术的两种或多种蛋白质是融合的。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：MB阿科，M科曼杜西，C加莱蒂，V马斯格阿尼，MM朱利亚尼，M皮扎，
申请(专利权)人：启龙股份公司，
类型：发明
国别省市：IT[意大利]