菲律宾蛤仔组织细胞培养方法技术

本发明专利技术涉及贝类组织细胞培养技术，具体地说是菲律宾蛤仔组织细胞培养方法，其特征在于包括以下步骤：（１）组织块的消毒灭菌处理：先用无菌过滤海水冲净组织块表面的粘液，再将组织块置于消毒液中浸泡消毒；（２）接种：将组织块均匀排布在涂有贴壁物质的培养瓶内壁上，在２６℃～２７℃恒温下预培养４～６小时，使接种的组织块贴壁牢固；（３）培养：添加培养液，在恒温培养箱中封闭培养，培养条件为温度２６℃～２７℃，ｐＨ７．２～７．４。本发明专利技术对组织块的消毒灭菌效果好，既可有效地杀灭组织表面的菌类，又可避免对组织的损伤，最大限度地保持组织活力，从而使组织块贴壁生长良好，细胞增殖速度快，并且操作简便易行。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及贝类组织细胞培养技术，具体地说是一种海洋埋栖型贝类菲律宾蛤仔的组织细胞体外培养方法。
技术介绍
菲律宾蛤仔Ruditapes philippinarum(Adams and Reeve，1850)属于软体动物门、瓣鳃纲、帘蛤目、帘蛤科、蛤仔属，是广泛分布于我国南北方沿海的一种埋栖型贝类，也是我国重要的海水养殖经济贝类之一，近年来人工养殖的规模不断扩大，但由于养殖过程中时有病毒性疾病发生，已成为威胁菲律宾蛤仔养殖业健康发展的制约因素。进行菲律宾蛤仔的组织细胞培养，对分离纯化病毒、研究病毒在菲律宾蛤仔细胞中的增殖特性以及防治病毒性疾病有重要意义。由于水生贝类的细胞代谢途径及增殖特性与哺乳动物有一定差异，所以组织细胞培养较之哺乳动物难度大。一方面，菲律宾蛤仔生活在泥沙底质中，因而其组织表面有大量的细菌和真菌等，组织细胞培养时往往因组织块消毒灭菌不彻底而造成污染；另一方面，现有的贝类组织细胞培养技术，存在细胞贴壁效果差、生长缓慢等缺点，不适合菲律宾蛤仔的组织细胞培养。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种适合海洋埋栖型贝类的菲律宾蛤仔组织细胞培养的方法。为实现上述目的，本专利技术采取的技术方案包括如下步骤(1)组织块的消毒灭菌处理用解剖器具剪取适量的菲律宾蛤仔组织，用无菌过滤海水冲净组织块表面的粘液，将冲洗好的组织块置于消毒液中浸泡消毒，再用Hank’s平衡盐溶液反复冲洗组织块，以去除多余的消毒液。(2)接种将组织块剪成1mm3左右的小块，均匀排布在涂有贴壁物质的细胞培养瓶底部内壁上，组织块的接种密度约为1小块/cm2。翻转培养瓶使贴有组织块一面的朝上，在培养瓶中加入少量培养液，不要使培养液与组织块接触，旋紧瓶塞后置于26℃～27℃恒温培养箱中预培养4～6小时，使接种的组织块贴壁牢固。(3)培养组织块牢固贴壁后，将培养瓶翻正，添加适量培养液使其浸泡组织块，置于恒温培养箱中封闭培养，培养条件为温度26℃～27℃，pH 7.2～7.4，每隔2～3天更换一次培养液。上述操作均在超净工作台或无菌室内完成。步骤(1)中所述无菌过滤海水为自然海水经脱脂棉过滤后，煮沸10～15分钟，冷却24小时后的海水。步骤(1)中所述消毒液，其配方和浸泡消毒时间分为以下三种①用三蒸水稀释的醋酸氯己定，稀释后的质量浓度为100μg/ml，浸泡消毒时间为30秒；②用无菌过滤海水稀释的苯扎溴铵，稀释后的质量浓度为300μg/ml，浸泡消毒时间为30秒；③用Hank’s平衡盐溶液配制的消毒液，其中含有青霉素4000国际单位/ml、链霉素5000μg/ml、制霉菌素400μg/ml、醋酸氯己定5μg/ml，浸泡消毒时间为10分钟。在步骤(1)的操作过程中，选择上述三种消毒液中的任意一种即可。步骤(2)中所述贴壁物质为多聚赖氨酸或按常规方法制备的鼠尾胶原。步骤(2)或(3)中所述培养液是用杜尔贝科氏改进的依格尔氏培养基(Dulbecco’s Modified Eagle Medium，缩写D-MEM)、199培养基(Medium 199，缩写M199)、依格尔氏低限量基础培养基(Eagle’sMinimum Essential Medium，缩写E-MEM)、1640培养基(Roswell Park Memorial InstituteMedium 1640，缩写RPMI-1640)中的任意一种作为基础培养基，用三蒸水配制并灭菌，而且每1000毫升培养液中加有以下物质氯化钠3.5g，小牛血清100ml，水解乳蛋白5g，植物血球凝集素5mg，青霉素8×104国际单位，链霉素100mg，制霉菌素5mg。培养液的pH调至7.4。本专利技术具有如下优点1.组织块消毒灭菌效果好。由于菲律宾蛤仔埋栖在泥沙底质中生活，其组织表面有大量的细菌和真菌，组织块消毒灭菌的效果是决定组织细胞培养成败的关键。用上述消毒液进行消毒灭菌，既可有效地杀灭组织表面的菌类，又可避免对组织的损伤，最大限度地保持组织的活力。2.组织块贴壁生长良好，细胞增殖速度快。这种培养方法最快在培养9～12小时后即有细胞从组织块迁出，培养5～8天后即可形成致密的单层增殖细胞。3.操作简便易行。无需特殊设备，在一般的无菌培养室内均可操作。具体实施例方式下面结合实施例对本专利技术作进一步详细说明。实施例1外套膜组织细胞的培养(1)外套膜组织块的消毒灭菌处理用解剖器具剪下适量的菲律宾蛤仔外套膜组织，用无菌过滤海水冲净外套膜表面的粘液，将冲洗好的外套膜置于用Hank’s平衡盐溶液配制的消毒液中，消毒液含有青霉素4000国际单位/ml、链霉素5000μg/ml、制霉菌素400μg/ml、醋酸氯己定5μg/ml，浸泡消毒10分钟。然后再用Hank’s平衡盐溶液反复冲洗外套膜，以去除多余的消毒液。(2)接种将外套膜剪成1mm3左右的小块，均匀排布在涂有多聚赖氨酸的25cm2细胞培养瓶内壁上，每瓶内共接种外套膜组织小块20块。翻转培养瓶使贴有外套膜组织块一面的朝上，在培养瓶中加入少量D-MEM培养液，不要使培养液与外套膜组织块接触，旋紧瓶塞后置于26℃～27℃恒温培养箱中预培养6小时，接种的外套膜组织块即牢固地贴附在培养瓶内壁上。(3)培养翻转培养瓶，使贴有外套膜组织块一面的朝下，添加适量D-MEM培养液使其浸泡外套膜组织块，置于恒温培养箱中封闭培养，培养条件为温度26℃～27℃，pH 7.2～7.4。培养12小时后在倒置显微镜下观察，即可见细胞迁出。培养期间每隔2～3天更换一次培养液。培养至第8天时，形成致密的单层增殖细胞。所述D-MEM培养液，是以D-MEM为基础培养基，用三蒸水配制并灭菌，而且每1000毫升培养液中加有以下物质氯化钠3.5g，小牛血清100ml，水解乳蛋白5g，植物血球凝集素5mg，青霉素8×104国际单位，链霉素100mg，制霉菌素5mg。培养液的pH调至7.4。实施例2 鳃组织细胞的培养(1)鳃组织块的消毒灭菌处理用解剖器具剪下适量的菲律宾蛤仔鳃组织，用无菌过滤海水冲净鳃表面的粘液，将冲洗好的鳃组织块置于用三蒸水稀释的含有醋酸氯己定质量浓度为100μg/ml的消毒液中，浸泡消毒30秒。然后再用Hank’s平衡盐溶液反复冲洗鳃组织块，以去除多余的消毒液。(2)接种将鳃组织块剪成1mm3左右的小块，均匀排布在涂有胶原的25cm2细胞培养瓶内壁上，每瓶内共接种鳃组织小块25块。翻转培养瓶使贴有鳃组织块一面的朝上，在培养瓶中加入少量M199培养液，不要使培养液与鳃组织块接触，旋紧瓶塞后置于26℃～27℃恒温培养箱中预培养4小时，接种的鳃组织块即牢固地贴附在培养瓶内壁上。(3)培养翻转培养瓶，使贴有鳃组织块一面的朝下，添加适量M199培养液使其浸泡鳃组织块，置于恒温培养箱中封闭培养，培养条件为温度26℃～27℃，pH 7.2～7.4。培养10小时后在倒置显微镜下观察，即可见细胞迁出。培养期间每隔2～3天更换一次培养液。培养至第5天时，形成致密的单层增殖细胞。所述M199培养液，是以M199为基础培养基，用三蒸水配制并灭菌，而且每1000毫升培养液中加有以下物质氯化钠3.5g，小牛血清100ml，水解乳蛋白5g，植物血球凝集素5mg，青霉素8×104国际单位，链霉素100mg，制霉菌素5本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种菲律宾蛤仔组织细胞的培养方法，其特征在于包括如下步骤：（１）组织块的消毒灭菌处理：用解剖器具剪取适量的菲律宾蛤仔组织，用无菌过滤海水冲净组织块表面的粘液，将冲洗好的组织块置于消毒液中浸泡消毒，再用Ｈａｎｋ’ｓ平衡盐溶液反复冲洗组 织块，以去除多余的消毒液。（２）接种：将组织块剪成１ｍｍ↑［３］左右的小块，均匀排布在涂有贴壁物质的细胞培养瓶底部内壁上，组织块的接种密度约为１小块／ｃｍ↑［２］。翻转培养瓶使贴有组织块一面的朝上，在培养瓶中加入少量培养液，不要使培 养液与组织块接触，旋紧瓶塞后置于２６℃～２７℃恒温培养箱中预培养４～６小时，使接种的组织块贴壁牢固。（３）培养：组织块牢固贴壁后，将培养瓶翻正，添加适量培养液使其浸泡组织块，置于恒温培养箱中封闭培养，培养条件为温度２６℃～２７℃，ｐ Ｈ７．２～７．４，每隔２～３天更换一次培养液。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：孙振兴，李云玲，
申请(专利权)人：孙振兴，
类型：发明
国别省市：37[中国|山东]