一种可拮抗DDX3蛋白RNA结合活性的多肽DIP-13及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种可拮抗DDX3蛋白RNA结合活性的多肽及其应用，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；还涉及一种抗肿瘤多肽及其应用，所述抗肿瘤多肽包括肿瘤细胞杀伤结构域和穿膜结构域，肿瘤细胞杀伤结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。本发明专利技术的抗肿瘤多肽的穿膜结构域本身没有细胞毒性，但连接肿瘤细胞杀伤结构域后，有明显的抑制肿瘤增殖、迁移侵袭的效应。本发明专利技术的抗肿瘤多肽，不仅可以单独作为抗肿瘤的生物治疗药物，还有望结合其他治疗方式来抑制肿瘤。

【技术实现步骤摘要】
一种可拮抗DDX3蛋白RNA结合活性的多肽DIP-13及其应用
本专利技术涉及肿瘤靶向治疗领域，更特别地，涉及一种可拮抗DDX3蛋白RNA结合活性的多肽及其应用。
技术介绍
肿瘤是严重威胁人类生命健康的疾病，随着工业化的进程，肿瘤的发病率逐年攀升。根据国际癌症研究中心(IARC)报告：未来几十年内，癌症发病人数仍将快速增长，预计2030年全球将有2136万癌症新发病例，死亡病例将达1315万，肿瘤治疗的需求将持续快速增长。传统手术、化疗、放疗是治疗肿瘤的主要手段，然而这些方法在治疗的同时，往往会带来很多副作用，给肿瘤患者及其家庭带来了极大的痛苦。因此，疗效显著、副作用少、特异性高的肿瘤靶向性治疗成为了目前研究的热点。肿瘤靶向治疗是指针对已明确的致癌位点(蛋白或DNA)，设计相应的靶向治疗药物，因其特异性高、副作用少，可显著降低肿瘤病人痛苦，在肿瘤治疗方面具有非常重要的应用前景。分子靶向治疗又被称为“生物导弹”，药物通过特异性地识别致癌位点来发挥作用，使肿瘤细胞特异性死亡，而对正常组织细胞几乎没有损伤。要满足这种要求，靶向药物成分的选择成为了关键，而多肽具有血浆清除速度快、亲和力高、组织细胞穿透性强、易于摄取、免疫原性低等特点，非常适合靶向药物的开发。DDX3蛋白由DDX3基因编码，属于DEAD-BOX蛋白家族，在进化过程中高度保守，是一种ATP依赖的RNA解旋酶，几乎参与了RNA在细胞内的所有生物代谢过程，包括前体mRNA的剪切和拼接、mRNA的转运、核糖体的组装以及mRNA的翻译等过程。近年来，大量研究表明：DEAD-BOX蛋白家族在肿瘤的发生、发展过程中发挥着非常重要的作用，而DDX3作为DEAD-BOX蛋白家族中至关重要的成员，逐渐成为了研究热点。临床研究发现，DDX3在包括胃癌、肝癌、乳腺癌、结肠癌等多种肿瘤组织中异常高表达，大数据生存分析显示：高表达DDX3患者的预后普遍较低表达DDX3患者的预后差。鉴于DDX3在研发肿瘤靶向治疗药物的巨大潜能，美国约翰霍普金斯大学医学院的研究团队在2016年研发出针对DDX3的抑制剂RK-33，这种化合物可竞争性结合DDX3的ATP结合功能区，并抑制其RNA结合能力，在肿瘤细胞和小鼠模型中均展现显著的抑癌功能；然而这种化合物由于缺乏特异性，无法满足肿瘤靶向治疗的需求。因此，需要构建一种既能靶向肿瘤细胞，又能高效入胞的新型多肽。
技术实现思路
为解决以上问题，专利技术人制备了一种生物活性肽，并将该多肽与细胞穿膜肽通过共价键连接起来，达到既有靶向肿瘤细胞，又具有高效入胞的效果。基于该研究，本专利技术提供了一种可拮抗DDX3蛋白RNA结合活性的多肽，其氨基酸序列如SEQIDNO:1所示。实验证明，该多肽可竞争性拮抗促癌基因DDX3与RNA的结合，并在细胞及动物水平表现出明显的肿瘤抑制作用。本专利技术还提供了上述可拮抗DDX3蛋白RNA结合活性的多肽在制备抗肿瘤药物中的应用。本专利技术还提供了一种抗肿瘤多肽，其包括肿瘤细胞杀伤结构域和穿膜结构域，所述肿瘤细胞杀伤结构域的氨基酸序列如SEQIDNO:1所示。优选地，所述穿膜结构域的氨基酸序列如SEQIDNO:2所示。优选地，所述穿膜结构域连接于所述肿瘤细胞杀伤结构域的N端。本专利技术还提供了上述抗肿瘤多肽在制备抗肿瘤药物中的应用。本专利技术的优点在于，抗肿瘤多肽的穿膜结构域本身没有细胞毒性，但连接DDX3的RNA结合活性肽段后，在细胞水平和动物水平均可观察到明显的肿瘤抑制效应。本专利技术的抗肿瘤多肽，不仅可以单独作为抗肿瘤的生物治疗药物，还有望结合其他治疗方式来抑制肿瘤。附图说明图1为DIP-13竞争性拮抗DDX3蛋白与RNA相互作用原理的示意图；图2为对照肽和DIP-13处理HeLa细胞48小时后的荧光显微镜照片；图3为不同浓度的DIP-13或对照肽处理HeLa细胞24小时后的MTT比色统计图；图4为20μmol/L的DIP-13或对照肽处理HeLa细胞24小时后的MTT比色统计图；图5为平板克隆形成实验照片；图6为根据图5计算的细胞克隆数的统计图；图7为Transwell细胞侵袭实验照片；图8为根据图7计算的肿瘤细胞的迁移数目的统计图；图9为小鼠体内实验中对照肽和DIP-13对肿瘤重量影响的统计图；图10为小鼠体内实验中对照肽和DIP-13对肿瘤体积影响的统计图；图11为对照肽和DIP-13对DDX3与RNA(HOTAIR)结合水平的影响的统计图。具体实施方式以下结合实例对本专利技术的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本专利技术，并非用于限定本专利技术的范围。1.抗肿瘤多肽的合成通过固相合成法合成一种抗肿瘤多肽，其包括一个肿瘤细胞杀伤结构域和一个穿膜结构域，其中肿瘤细胞杀伤结构域序列如SEQIDNO:1所示，穿膜结构域序列如SEQIDNO:2所示，连接于肿瘤细胞杀伤结构域的N端，所得到的序列为：氨基酸序列为YGRKKRRQRRR-VLAPTRELAVQIK(SEQIDNO:3)，命名为DIP-13。为了研究方便，我们在抗肿瘤多肽的C端连接异硫氰酸荧光素标记FITC，N端连接生物素标记Biotin。DIP-13竞争性拮抗DDX3蛋白与RNA相互作用的原理如图1所示。2.DIP-13的细胞定位检测取对数生长期的HeLa细胞，用无菌1×PBS重悬，经过计数后按每孔10000个细胞种植于内置无菌爬片的24孔板内，吹打均匀后置于37℃恒温培养箱、含10％胎牛血清的高糖DMEM培养基中培养，培养过夜后加入20μmol/L的多肽，维持24小时和48小时。弃去上清，1×PBS洗两次后采用4％多聚甲醛固定，室温固定30分钟后弃甲醛，用1×PBS洗两次，然后采用DAPI染核，3-5分钟后再次用1×PBS洗两次，然后纯甘油制片，整个操作过程均要求严格避光；制片结束后在激光共聚焦显微镜下观察带有FITC荧光基团的多肽在细胞内的定位。实验结果如图2所示，DIP-13能够有效被细胞摄取，48小时后多肽积聚于肿瘤细胞的细胞核，呈现强胞核染色。3.MTT比色法分析检测DIP-13对肿瘤细胞生长的抑制作用采用人宫颈癌细胞HeLa细胞，进行MTT细胞活力比色实验。取对数生长期的HeLa细胞，用无菌1×PBS重悬，经过计数后按每孔5000个细胞种植于96孔板内，每个样品设定10个复孔，吹打均匀后置于37℃恒温培养箱、含10％胎牛血清的高糖DMEM培养基中培养，培养过夜后分别加入不同浓度的多肽，该浓度梯度为0、5μmol/L、10μmol/L、15μmol/L、20μmol/L及25μmol/L，维持24小时后收细胞；然后多肽以20μmol/L加入到培养基中，分别在0、24、48、72及96小时收获细胞。到达标定时间后，弃去上清，每孔加入90μlDMEM培养基和10μlMTT溶液，置于37℃培养箱中反应4小时，反应结束后弃上清，用1×PBS洗两次，向样品孔中加入100μl二甲基亚砜(DMSO)溶液，10分钟后用酶标仪检测490nm吸光度值。结果如图3和4所示，与对照组多肽相比，DIP-13多肽处理的实验组肿瘤细胞的活力显著降低，并且该作用呈时间和剂量依赖性，说明该新型多肽可有效降低肿瘤细胞的细胞活力；当处理细胞时间相同时，多肽浓度为20-25μmol/L的细胞活力抑制率较高；当处理本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种可拮抗DDX3蛋白RNA结合活性的多肽，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

【技术特征摘要】
1.一种可拮抗DDX3蛋白RNA结合活性的多肽，其特征在于，氨基酸序列如SEQIDNO:1所示。2.权利要求1所述的可拮抗DDX3蛋白RNA结合活性的多肽在制备抗肿瘤药物中的应用。3.一种抗肿瘤多肽，其特征在于，包括肿瘤细胞杀伤结构域和穿膜结构域，所述肿瘤细胞杀伤结构域的氨基酸序列如SE...

【专利技术属性】
技术研发人员：童强松，郑丽端，杨枫，陈亚俊，李欢欢，叶霖，李聃，宋华杰，
申请(专利权)人：华中科技大学同济医学院附属协和医院，
类型：发明
国别省市：湖北,42