一种针对前列腺癌的cDC疫苗的制备方法技术

涉及细胞免疫领域，特别涉及一种针对前列腺癌的cDC疫苗的制备方法。本发明专利技术通过分离TRAMP‑C1细胞裂解上清液得到肿瘤细胞裂解上清液；提取骨髓干细胞诱导分化为树突细胞，并通过流式分选得到cDC；将得到的肿瘤细胞裂解上清液与得到的cDC按2.5‑3.5：1混合培养；添加GM‑CSF和IL‑4后继续培育后得到针对前列腺癌的cDC疫苗；在前列腺癌小鼠模型TRAMP中，通过尾静脉注射cDC疫苗显著抑制前列腺癌的进展。本发明专利技术的有益效果在于cDC疫苗的制备过程清晰明确，可重复性强，得到的cDC疫苗可以显著抑制前列腺癌的进展，为前列腺癌的临床细胞治疗提供了可能。

A method for preparing cDC vaccine against prostate cancer

In the field of cellular immunity, in particular, a method for the preparation of a cDC vaccine against prostate cancer. The tumor cell lysate were separated by TRAMP C1 cell lysate supernatant; bone marrow stem cells to differentiate into dendritic cells, and cDC by flow cytometry; the tumor cell lysate supernatant obtained with cDC obtained by 2.5 3.5:1 mixed culture; adding GM CSF and IL 4 continue to cultivate according to cDC of prostate cancer vaccine; in prostate cancer mouse model TRAMP in progress by intravenous injection of cDC vaccine significantly inhibit prostate cancer. The beneficial effect of the invention is the preparation process of cDC vaccine is clear, reproducible, progress cDC vaccine can significantly inhibit prostate cancer, provides the possibility for clinical treatment of prostate cancer cells.

【技术实现步骤摘要】
一种针对前列腺癌的cDC疫苗的制备方法
本专利技术涉及细胞免疫领域，特别涉及一种针对前列腺癌的cDC疫苗的制备方法。
技术介绍
前列腺癌是世界范围内男性中最常见的一种癌症，在中国前列腺癌的发病率逐年上升。传统的治疗方法最终会导致前列腺癌的复发和转移，因此，寻找新的前列腺癌的治疗方法具有深远的意义。Sipuleucel-T疗法激活所有的APC，包括DC、巨噬细胞甚至单核细胞，成分复杂，且针对前列腺癌病人临床治疗效果有限。DC细胞有不同的亚型，包括cDC，类浆DC(plasmacytoidDC,pDC)和单核细胞来源的DC(monocyte-derivedDCs,MoDC)，每一种DC在细胞免疫治疗中的作用不尽相同。现有的DC疫苗的制备以所有的DC为基础，得到的DC疫苗具有具有异质性，特异性较差，且效果不好。cDC是树突状细胞(DendriticCell,DC)的一种亚型，是体内功能最强的抗原提呈细胞(AntigenPresentingCell,APC)，连接先天性免疫和后天性免疫，感应癌症的发生和病原体对机体的侵犯。在抗原识别、抗原加工和抗原递呈，刺激T细胞增殖，诱导特异性免疫反应等过程中发挥至关重要的作用。2010年，美国FDA批准的针对前列腺癌的Sipuleucel-T疗法是基于APC，特别是DC的大量扩增和激活。之后，以DC为基础的细胞治疗进展迅速，取得许多重要成果，是细胞治疗领域研究的热点。
技术实现思路
本专利技术的目的提供一种针对前列腺癌的特异性、高效性的cDC疫苗的制备方法，该疫苗成分单一，功能明确，具有强大的抗原递呈功能。为解决上述技术问题，本专利技术通过如下技术方案实现：一种针对前列腺癌的cDC疫苗的制备方法，包括如下步骤：(1)分离TRAMP-C1细胞裂解上清液得到肿瘤细胞裂解上清液；(Tumorlysate)(2)提取骨髓单细胞诱导分化为树突细胞，并通过流式分选得到cDC；(3)将步骤(1)中得到的肿瘤细胞裂解上清液与步骤(2)中得到的cDC2.5-3.5：1的细胞数量比例混合培养；添加GM-CSF和IL-4后继续培育后得到针对前列腺癌的cDC疫苗。其中，所述的步骤(1)中制备肿瘤细胞裂解上清液Tumorlysate的方法为在3-7％CO2，36-37℃环境下，将TRAMP-C1细胞在含8-12％FBS、0.5-2％PBS的DMEM培养基中培养24-36小时；传代，扩大培养，将处于对数期的TRAMP-C1细胞用胰酶消化1-3分钟，用含8-12％FBS的DMEM终止消化，离心，弃上清，将细胞团重悬于1-5×107cells/ml的PBS中；反复冻融5-6次；室温，离心,取上清即得到肿瘤细胞裂解上清液；所述冻融条件为液氮1-3分钟，50-60℃水浴1-3分钟。可以为将液氮中保存的TRAMP-C1细胞在37℃水浴锅复苏，加4ml的含10％FBS、1％P/S的DMEM培养基，培养于T25细胞培养瓶中，放置于含5％CO2的37℃细胞培养箱。其中，所述的步骤(2)中骨髓单细胞源自C57BL/6小鼠。可以取饲养于SPF级的12周龄的雄性C57BL/6小鼠，颈椎脱臼法处死。在超净台中，将小鼠四肢用大头针固定于泡沫板上，喷洒70％的酒精消毒。用灭菌的手术器械剪开小鼠皮肤，手术取出小鼠股骨和胫骨的骨髓；红细胞裂解液裂解骨髓中的红细胞并冲洗、离心后去除；调整细胞浓度为0.5-1x106/ml。其中，所述的步骤(2)中诱导的方法为用GM-CSF和IL-4进行体外诱导培养的骨髓来源的树突细胞的悬液。其中，所述骨髓干细胞浓度为0.5-1x106/ml时，GM-CSF和IL-4的添加量分别为20ng/ml和10ng/ml。例如:加入重组小鼠GM-CSF(20ng/ml)和IL-4(10ng/ml)，37℃，5％CO2培养箱培养；每2天轻轻摇晃培养板，然后3/4体积更换新鲜培养液，并补足细胞因子。其中，所述的步骤(2)中流式分选的方法是先用CD11C-FITC和MHCII-PE的流式抗体染色，然后用BD流式细胞分选机进行流式分选。可以在CD11C-FITC和MHCII-PE的流式抗体染色体外诱导培养的骨髓来源的树突细胞的悬液，室温避光30分钟。加PBS洗去没有与细胞结合的流式抗体。在BD流式细胞分选机分选cDC，收集于含20％FBS的DMEM培液中。CD11ChiMHCII+的细胞即为cDC，其中，所述的步骤(3)中混合培养的条件为37℃4小时。其中，所述的步骤(3)中GM-CSF的添加量为10-20ng/ml,IL-4的添加量为3-5ng/ml。其中，所述的步骤(3)中继续培养的条件为37℃16小时。针对前列腺癌的cDC疫苗效率的验证：将孵育后的cDC在室温，1200～1800rpm离心3～5分钟，弃上清，用PBS重悬，浓度为0.5～2×106cells/200ulPBS。将cDC疫苗通过尾静脉注射进12周龄的雄性TRAMP小鼠，同时以相同体积的PBS尾静脉注射12周龄的雄性TRAMP小鼠作为对照。12周之后，观察前列腺癌的发展，验证cDC疫苗的效率。本专利技术的有益效果是：(1)本专利技术中选取的cDC是DC细胞的一种亚型，没有包括pDC或MoDC以及诱导过程产生的巨噬细胞。相比于以往的DC疫苗，成分单一，功能明确，具有强大的抗原递呈功能。(2)本专利技术制备针对前列腺癌的cDC疫苗的方法，步骤简单，清晰明确，可重复性强，且在小鼠体内实验中验证了cDC疫苗的功能。(3)本专利技术为临床制备cDC疫苗，治疗前列腺癌提供了实验基础。附图说明图1：是本专利技术cDC的流式分选示意图。图2：泌尿生殖系统(Genitourinary,GU)与体重(Bodyweight,BW)的比例对比示意图。图3：前列腺癌细胞的增殖对比图。图4：是本专利技术cDC疫苗抑制前列腺癌的大小对比图。具体实施方式下面结合实施例，对本专利技术作进一步说明：实施例1(1)将液氮中保存的TRAMP-C1细胞在37℃水浴锅复苏，加4ml的含10％FBS、1％P/S的DMEM培养基，培养于T25细胞培养瓶中，放置于含5％CO2的37℃细胞培养箱；(2)36小时之后，传代，扩大培养，将处于对数期的TRAMP-C1细胞用胰酶消化2分钟，用含10％FBS的DMEM终止消化，离心，弃上清，将细胞团重悬于PBS中，浓度为107cells/mlPBS；(3)将重悬的TRAMP-C1细胞加入1.5mlEP管中，用封口膜封住EP管后反复冻融，液氮2分钟—56℃水浴2分钟，重复5次；1700rmp，室温，离心5分钟,取上清，置于-80℃备用。(4)取饲养于SPF级的12周龄的雄性C57BL/6小鼠，颈椎脱臼法处死，在超净台中，将小鼠四肢用大头针固定于泡沫板上，喷洒70％的酒精消毒，用灭菌的手术器械剪开小鼠皮肤，手术取出小鼠股骨和胫骨的骨髓，用注射器轻轻机械研磨，研磨充分后，用的灭菌软管将骨髓细胞转移到离心管里，加PBS后，用40um的细胞筛过滤，滤液在1500rpm，室温条件下，离心5分钟，尽量去除上清液，加入3ml红细胞裂解液，轻轻混匀，冰上裂解3分钟，加3倍体积的PBS终止裂解过程，1500rpm，室温条件下，离心5分钟，去上清，PBS清洗并用细胞筛过滤3遍，得到骨髓单细胞悬液；本过程注意：1.本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种针对前列腺癌的cDC疫苗的制备方法，其特征在于,包括如下步骤：(1)反复冻融小鼠前列腺癌细胞系TRAMP‑C1，离心，得到肿瘤细胞裂解上清液；(2)提取骨髓干细胞诱导分化为树突细胞，并通过流式分选得到cDC；(3)将步骤(1)中得到的肿瘤细胞裂解上清液与步骤(2)中得到的cDC按2.5‑3.5：1的细胞数量比例混合培养；添加GM‑CSF和IL‑4后继续培育后得到针对前列腺癌的cDC疫苗。

【技术特征摘要】
1.一种针对前列腺癌的cDC疫苗的制备方法，其特征在于,包括如下步骤：(1)反复冻融小鼠前列腺癌细胞系TRAMP-C1，离心，得到肿瘤细胞裂解上清液；(2)提取骨髓干细胞诱导分化为树突细胞，并通过流式分选得到cDC；(3)将步骤(1)中得到的肿瘤细胞裂解上清液与步骤(2)中得到的cDC按2.5-3.5：1的细胞数量比例混合培养；添加GM-CSF和IL-4后继续培育后得到针对前列腺癌的cDC疫苗。2.根据权利要求1所述的针对前列腺癌的cDC疫苗的制备方法，其特征在于：所述的步骤(1)中制备肿瘤细胞裂解上清液Tumorlysate的方法为在3-7％CO2，36-37℃环境下，将TRAMP-C1细胞在含8-12％FBS、0.5-2％PBS的DMEM培养基中培养24-36小时；传代，扩大培养，将处于对数期的TRAMP-C1细胞用胰酶消化1-3分钟，用含8-12％FBS的DMEM终止消化，离心，弃上清，将细胞团重悬于1-5×107cells/ml的PBS中；反复冻融5-6次；室温，离心,取上清即得到肿瘤细胞裂解上清液；所述冻融条件为液氮1-3分钟，50-60℃水浴1-3分钟。3.根据权利要求1所述的针对前列腺癌的cDC疫苗的制备方法...

【专利技术属性】
技术研发人员：张岩，张倩飞，
申请(专利权)人：上海交通大学，
类型：发明
国别省市：上海,31