多交叉扩增结合金纳米生物传感检测副溶血性弧菌的方法技术

本发明专利技术公开了一种多交叉扩增结合金纳米生物传感检测副溶血性弧菌的方法，所述方法在多交叉置换扩增中的交叉引物CP1或CP2的5’端标记生物素，在扩增引物C1或C2的5’端标记半抗原，所述方法针对副溶血性弧菌toxR基因的扩增产物能被金纳米生物传感器可视化检测。所述方法便捷、快速、敏感、特异，适宜于各种核苷酸片段检测。

【技术实现步骤摘要】
多交叉扩增结合金纳米生物传感检测副溶血性弧菌的方法
本专利技术公开了一种副溶血性弧菌的检测方法，属于微生物学领域。
技术介绍
副溶血性弧菌(Vibrioparahaemolyticus)是一种呈丝状，弧状或杆状的革兰氏阴性菌，无芽孢形成。该病原体是重要的食源性疾病病原体，是广泛存在于河口、沿海及海洋环境中的嗜盐菌。副溶血性弧菌常分离自海产品及临床标本，引起海产品源性的肠热症，临床症状表现为发热、腹泻。据WHO数据统计，副溶血性弧菌被认为是引起海产品源性疾病最主要的因素。副溶血性弧菌食物中毒，是进食含有该菌的食物所致，主要来自海产品，如墨鱼、海鱼、海虾、海蟹、海蜇，以及含盐分较高的腌制食品，如咸菜、腌肉等。本菌存活能力强，在抹布和砧板上能生存1个月以上，海水中可存活47天。全球每年有7万病人死于海产品源性腹泻，而绝大多数海产品源性的腹泻病例是副溶血性弧菌导致，从而受到世界各国的高度关注，成为各国的重大公共卫生问题。因此，为了给予临床病人准确快速的治疗，开展海产品监测以及副溶血性弧菌的流行病学调查，研发一个省时、省力和特异性较高的检测方法，能够同时检测和鉴定副溶血性弧菌成为必要。目前对于副溶血性弧菌的检测主要依赖于传统的增菌培养和生化鉴定。该方法耗时大约5到7天，包括增菌、选择培养及后续的生化鉴定，其劣势是耗时耗力，生化结果的判读依赖于人的主观判断，导致结果重复性差，易错判。随着核酸诊断技术的快速发展，一些以PCR为基础的诊断技术(如普通PCR技术，荧光PCR技术)被用于副溶血性弧菌的快速检测，然而这些方法依赖于昂贵的仪器设备，需要后续的电泳操作，昂贵的探针合成，以及熟练的操作人员。对于一些落后的实验室无法进行，限制了这些技术的运用。目前运用这些检测技术诊断副溶血性弧菌(Vibrioparahaemolyticus)的PCR方法和Real-timePCR方法，检测灵敏度差，检测过程耗时较长，不利于快速检测和应急检测。为了克服PCR扩增技术的劣势，近年来发展了许多恒温扩增技术。恒温扩增技术较PCR技术而言，不依赖于热循环扩增设备，反应速度快，敏感性好。因此，恒温扩增技术有利于实现快速扩增，便捷检测及现场诊断。到目前为止，已发展的恒温扩增技术有10余种，应用较为广泛的有滚环扩增(RCA)、链置换扩增(SDA)、解旋酶依赖的恒温扩增(HDA)、环介导恒温扩增(LAMP)、交叉扩增(CPA)等。然而，这些恒温技术实现核酸扩增需要多种酶同时工作，依赖于昂贵的试剂，复杂的操作步骤。因此这些方法的实用性、便捷性、可操作性有待于提高，尤其是在快速诊断领域及欠发达地区。为了克服PCR技术及现有恒温扩增技术的劣势，实现便捷、快速、敏感及特异的扩增核酸序列，在生物、农业、医学等领域，专利技术人近期已经建立了一种新的核酸扩增技术，命名为多交叉置换扩增(MultipleCrossDisplacementAmplification，MCDA)，相关内容公开于CN104946744A，该专利文件作为现有技术文件构成本申请说明书的一个部分。MCDA在恒温条件下实现核酸扩增，仅使用一种恒温置换酶、扩增速度快、反应灵敏、特异性高。为了使该技术在生物、医药及卫生领域应用更广泛、更经济。近期，专利技术人以MCDA为基础，将MCDA技术与纳米生物检测技术相结合，开发了依赖MCDA技术，实现快速、敏感检测的纳米生物传感技术，该技术被命名为多交叉恒温扩增结合金纳米生物传感的核酸诊断技术(MultipleCrossDisplacementAmplificationlabel-basedgoldNanoparticlesLateralFlowBiosensor,MCDA-LFB)，相关内容已申请于CN201610872509.4、CN201610942289.8、CN201610982015.1。本专利技术将MCDA-LFB技术用于副溶血性弧菌的检测，针对副溶血性弧菌的特异基因toxR设计一套MCDA扩增引物，旨在验证、评价MCDA-LFB技术及建立针对副溶血性弧菌的快速、敏感和特异的MCDA-LFB检测体系。
技术实现思路
基于上述专利技术目的，本专利技术首先提供了一种应用多交叉扩增结合金纳米生物传感检测目的基因的方法，所述方法包括以下步骤：(1)提取待检测样品的基因组；(2)提供置换引物F1和F2，提供交叉引物CP1和CP2，同时提供在交叉引物CP1或CP2的5’端标记有生物素的交叉引物CP1*或CP2*；提供扩增引物C1和C2，D1和D2，R1和R2，同时提供在所述扩增引物C1或C2的5’端标记半抗原的扩增引物C1*或C2*；(4)在链移位型聚合酶(Bst)、解链温度调节剂、引物存在下，使用待检测样品的基因组片段作为模板恒温扩增DNA；(5)使用金纳米生物传感器检测步骤(4)的扩增产物。在一个优选的技术方案中，在所述扩增引物C1*或C2*的5’端所标记的半抗原为荧光素(FITC)。更为优选地，在交叉引物CP1*的5’端标记生物素，在所述扩增引物C1*的5’端标记荧光素。在一个更为优选的技术方案中，所述金纳米生物传感器包括一背板，在所述背板上依次设置装有样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜及吸水垫，在所述硝酸纤维素膜上依次设置检测线及控制线，在金标垫、检测线及控制线区域依次包被有金纳米粒子偶联的链霉素亲和素、抗荧光素抗体及生物素偶联的牛血清蛋白。在一个优选的技术方案中，所述恒温扩增是在61-64℃的环境中进行的。在一个更为优选的技术方案中，所述恒温扩增是在62℃的环境中进行的。在一个优选的技术方案中，所述目的基因为副溶血性弧菌的toxR。优选地，所述置换引物F1的序列如SEQIDNO:1所示，所述置换引物F2的序列如SEQIDNO:2所示；所述交叉引物CP1的序列如SEQIDNO:3所示，在所述交叉引物CP1的5’端标记有生物素的所述交叉引物CP1*的序列如SEQIDNO:4所示，所述交叉引物CP2的序列如SEQIDNO:5所示，引物C1的序列如SEQIDNO:6所示，在所述引物C1的5’端标记有荧光素的引物C1*的序列如SEQIDNO:7所示，引物C2的序列如SEQIDNO:8所示，引物D1的序列如SEQIDNO:9所示，引物D2的序列如SEQIDNO:10所示，引物R1的序列如SEQIDNO:11所示，引物R2的序列如SEQIDNO:12所示。本专利技术在另一方面还提供了一组用于多交叉扩增副溶血性弧菌toxR基因的引物序列，所述序列包括：如SEQIDNO:1所示的置换引物F1，如SEQIDNO:2所示的置换引物F2，如SEQIDNO:3所示的交叉引物CP1，如SEQIDNO:5所示的交叉引物CP2，如SEQIDNO:6所示的扩增引物C1，如SEQIDNO:8所示的扩增引物C2，如SEQIDNO:9所示的扩增引物D1，如SEQIDNO:10所示的扩增引物D2，如SEQIDNO:11所示的扩增引物R1，如SEQIDNO:12所示的扩增引物R2，同时提供在交叉引物CP1或CP2的5’端标记有生物素的交叉引物CP1*或CP2*，以及在所述扩增引物C1或C2的5’端标记半抗原的扩增引物C1*或C2*。在一个优选的技术方案中，在交叉引物CP1*的5’端标记生物素，在扩增引物C1*的5本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种多交叉恒温扩增结合金纳米生物传感检测目的基因的方法，所述方法包括以下步骤：(1)提取待检测样品的基因组；(2)提供置换引物F1和F2，提供交叉引物CP1和CP2，同时提供在交叉引物CP1或CP2的5’端标记有生物素的交叉引物CP1*或CP2*；提供扩增引物C1和C2，D1和D2，R1和R2，同时提供在所述扩增引物C1或C2的5’端标记半抗原的扩增引物C1*或C2*；(4)在链移位型聚合酶、解链温度调节剂、引物存在下，使用待检测样品的基因组的核酸作为模板恒温扩增DNA；(5)使用金纳米生物传感器检测步骤(4)的扩增产物。

【技术特征摘要】
1.一种多交叉恒温扩增结合金纳米生物传感检测目的基因的方法，所述方法包括以下步骤：(1)提取待检测样品的基因组；(2)提供置换引物F1和F2，提供交叉引物CP1和CP2，同时提供在交叉引物CP1或CP2的5’端标记有生物素的交叉引物CP1*或CP2*；提供扩增引物C1和C2，D1和D2，R1和R2，同时提供在所述扩增引物C1或C2的5’端标记半抗原的扩增引物C1*或C2*；(4)在链移位型聚合酶、解链温度调节剂、引物存在下，使用待检测样品的基因组的核酸作为模板恒温扩增DNA；(5)使用金纳米生物传感器检测步骤(4)的扩增产物。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在所述扩增引物C1*或C2*的5’端所标记的半抗原为荧光素。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，在交叉引物CP1*的5’端标记生物素，在所述扩增引物C1*的5’端标记荧光素。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述金纳米生物传感器包括一背板，在所述背板上依次设置装有样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜及吸水垫，在所述硝酸纤维素膜上依次设置检测线及控制线，在金标垫、检测线及控制线区域依次包被有金纳米粒子偶联的链霉素亲和素、抗荧光素抗体及生物素偶联的牛血清蛋白。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述恒温扩增是在61-64℃的环境中进行的。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述恒温扩增是在62℃的环境中进行的。7.根据权利要求1-6任一所述的方法，其特征在于，所述目的基因为副溶血性弧菌的toxR。8.根据权利要求7的所述的方法，其特征在于，所述置换引物F1的序列如...

【专利技术属性】
技术研发人员：叶长芸，王毅，王艳，
申请(专利权)人：中国疾病预防控制中心传染病预防控制所，
类型：发明
国别省市：北京,11