本发明专利技术涉及微电极生物传感技术，具体公开了一种活体在线检测植物生长素的微电极生物传感器。本发明专利技术通过在金(或铂)工作电极上修饰IAA的抗体实现对IAA的特异性识别，通过在电极上沉积金纳米粒子及修饰IAA‑金纳米粒子复合物实现IAA的高灵敏检测。本发明专利技术通过对活体植物体内IAA的在线连续检测，原位实时的掌握植物体内生长素的动态变化信息，了解IAA的代谢过程，为了解IAA参与植物生命体系的调控机理提供理论依据。应用微型生物传感器实现对植物活体内IAA的在线连续检测，对被检测样本不造成本质伤害；得到的数据结果可实时动态的反映植物体内IAA的含量变化，实际应用操作简便，易于掌握。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及微电极生物传感技术，具体地说，涉及一种活体在线检测植物生长素的微电极生物传感器。
技术介绍
作为植物体内的一种小分子有机物，生长素(IAA)主要参与植物的生长及发育过程。生长素对植物胚芽鞘尖端、幼嫩的芽、叶等的诱导通常具有正负两重性，主要取决于其浓度和植物的生理状况。通常情况下，过多的生长素会促进植物体内乙烯的产生，打乱植物内部的生理平衡，从而抑制植物的生长。另一方面，植物果实的发育离不开生长素。种子在发育过程中，产生的生长素能够改变其营养物质的分配，使子房发育为果实。目前，常用的生长素检测方法主要有酶免疫(ELISA)检测法、放射免疫分析(RIA)法、高效液相色谱(HPLC)法、气相色谱(GC)法等。除此之外，近年来，光谱法、电化学法等也被应用于生长素的检测。但目前的检测方法都是破坏植物样本的离体检测，仅能反应某一时间点的静态浓度或累积效应。传统检测方法需对样品取样进行分离提纯等预处理，不仅操作繁琐、耗时成本高，对样本的破坏性较大，而且只能离体取样检测，无法体现样本内IAA含量的实时动态变化。植物体内的生长素的含量极少且生长素周围共存基体成分非常复杂，其含量易受光照条件、水分以及温度等外界条件的影响，因此，随着研究的深入，研究者更希望获得植物适应外界环境时生长素的实时动态变化。
技术实现思路
为了解决现有技术中存在的问题，本专利技术的目的是提供一种活体在线检测植物生长素的微电极生物传感器及其应用。为了实现本专利技术目的，本专利技术的技术方案如下：第一方面，本专利技术提供了一种活体在线检测植物生长素的微电极生物传感器，所述微电极生物传感器中工作电极的制备方法包括如下步骤：S1、将金工作电极或铂工作电极浸入HAuCl4溶液中，在工作电极上经电化学沉积得到AuNPs修饰的工作电极；S2、在S1所得的工作电极上滴涂巯基十一酸(MUA)，使MUA通过Au–S键组装到S1所得的工作电极上；S3、在S2所得的工作电极上滴涂含有N羟基琥珀酸亚胺(NHS)和1-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)的混合溶液，激活MUA的羧基；S4、在S3所得的工作电极上滴涂AuNPs-抗IAA复合物，得到IAA抗体修饰的工作电极；S5、在S4所得的工作电极上滴涂K3Fe(CN)6媒介体。为了更好地实现工作电极对IAA检测的灵敏度和特异性，本专利技术对工作电极的修饰条件进行进一步的优化，具体如下：S1、将金工作电极或铂工作电极浸入含0.5～1MKNO3的2-5mMHAuCl4溶液中，在工作电极上-0.4V电化学沉积200s得到AuNPs修饰的工作电极；S2、在S1所得的工作电极上滴涂1～5mM巯基十一酸(MUA)，孵育1～2h后用水冲去多余未反应的MUA，使MUA通过Au–S键组装到S1所得的工作电极上；S3、在S2所得的工作电极上滴涂含有50mMN羟基琥珀酸亚胺和1-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(200mM)的混合溶液，孵育1-2h后，激活MUA的羧基；所述N羟基琥珀酸亚胺和1-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的混合溶液中N羟基琥珀酸亚胺与1-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的摩尔浓度比为1:1～1:4；S4、在S3所得的工作电极上滴涂AuNPs-抗IAA复合物，孵育1～4h得到IAA抗体修饰的工作电极；S5、在S4所得的工作电极上滴涂5～10mMK3Fe(CN)6媒介体。作为优选，所述工作电极最佳的制备方法包括：S1、将金工作电极或铂工作电极浸入含1MKNO3的3mMHAuCl4溶液中，在工作电极上-0.4V电化学沉积200s得到AuNPs修饰的工作电极；S2、在S1所得的工作电极上滴涂2mM巯基十一酸(MUA)，孵育1h后用水冲去多余未反应的MUA，使MUA通过Au–S键组装到S1所得的工作电极上；S3、在S2所得的工作电极上滴涂含有N羟基琥珀酸亚胺和1-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的混合溶液，孵育1-2h后，激活MUA的羧基；所述混合溶液中，N羟基琥珀酸亚胺的浓度为50mM，1-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的浓度为200mM；S4、在S3所得的工作电极上滴涂AuNPs-抗IAA复合物，孵育1h得到IAA抗体修饰的工作电极；S5、在S4所得的工作电极上滴涂5mMK3Fe(CN)6媒介体。本专利技术首先在金工作电极上沉积了金纳米粒子，研究发现，电极上沉积金纳米粒子后，可以显著增加电极的表面积，从而大大提高检测的灵敏度。其次，本专利技术对HAuCl4溶液的浓度进行了优化，发现HAuCl4浓度在2～5mM时效果较好，其中3mM的效果最好。在此基础上，本专利技术对电化学沉积的条件进行了优化，在-0.4V电化学沉积200s能够使AuNPs沉积的更加均匀，从而提高检测的灵敏度。而后，本专利技术在金纳米粒子修饰的工作电极上滴涂了巯基十一酸(MUA)以提供羧基，并对其浓度进行了优化，发现1-5mM的MUA效果较好，浓度太低不足以覆盖电极表面，太高则影响电极的导电性，进而降低检测性能，其中2mM的效果最好。进一步在电极上滴涂NHS和EDC的混合溶液，以激活羧基。NHS和EDC的浓度比为1：1-1:4，其中1:4效果最好。然后将AuNPs-抗IAA复合物滴涂到工作电极上，孵育1-4h得到IAA抗体修饰的工作电极。利用IAA的抗体实现对IAA的特异性检测，而AuNPs-抗IAA复合物则可进一步增强检测信号，从而提高检测的灵敏度。进一步地，S4中所述AuNPs-抗IAA复合物的制备方法为：通过柠檬酸钠还原法制备金纳米粒子，将金纳米粒子溶液的pH调节至7.6，在400μL金纳米粒子溶液中加入100μL抗IAA的抗体(1mg/ml)，震荡5min后，于4℃孵育12h；然后将混合物在4℃、12000rpm离心30min，以除去未连接的抗体；之后将沉淀分散于1ml含1％BSA、pH7.4的PBS缓冲液中，形成AuNPs-抗IAA复合物。进一步地，所述微电极生物传感器还包括Ag/AgCl参比电极和铂对电极。进一步地，为了使所述微电极生物传感器适用于植物活体的在线检测，避免离体检测对样品的破坏和取样过程中样品的变化和损失，本专利技术采用针式微电极，微电极通过涂膜、蚀刻技术等微机电加工(MEMS)技术制作，在硅片基质上制备上述工作电极、Ag/AgCl参比电极和铂对电极，其外观具有穿透植物组织的能力，长度约为30～50mm。第二方面，本专利技术提供了所述微电极生物传感器在活体在线检测植物生长素方面的应用。所述植物包括林木、花卉、蔬菜、农作物等，所述植物组织为植物的茎、叶、果实。进一步地，本专利技术提供一种活体在线检测植物生长素的方法，所述方法包括：1)将所述微电极生物传感器连接至电化学工作站，与IAA的标准溶液反应，通过电化学循环伏安法确定反应电压为0.2V；然后将微电极与不同浓度的IAA的标准溶液反应，在0.2V工作电压下通过计时电流法进行连续检测，将峰电流值与IAA的浓度值作图，制备标准曲线；2)将微电极生物传感器插入待测植物组织，连接电化学工作站，在0.2V工作电压下，通过计时电流法检测被测部位的电流I，通过与步骤1)所述的标准曲线的方程对比，计算得到待测组织的实时IAA浓度。在本专利技术的一个具体实施方式中，选择黄豆幼苗的茎秆为材料，活体检测IAA含量。将微电极生物传感器插入黄豆幼苗的茎秆部位进行活体检测，并与电化学工作站相本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种活体在线检测植物生长素的微电极生物传感器，其特征在于，所述微电极生物传感器中工作电极的制备方法包括如下步骤：S1、将金工作电极或铂工作电极浸入HAuCl4溶液中，经电化学沉积得到AuNPs修饰的工作电极；S2、在S1所得的工作电极上滴涂MUA，使MUA通过Au–S键组装到S1所得的工作电极上；S3、在S2所得的工作电极上滴涂含有N羟基琥珀酸亚胺和1‑3‑乙基碳二亚胺盐酸盐的混合溶液，激活MUA的羧基；S4、在S3所得的工作电极上滴涂AuNPs‑抗IAA复合物，得到IAA抗体修饰的工作电极；S5、在S4所得的工作电极上滴涂K3Fe(CN)6媒介体。
【技术特征摘要】
1.一种活体在线检测植物生长素的微电极生物传感器，其特征在于，所述微电极生物传感器中工作电极的制备方法包括如下步骤：S1、将金工作电极或铂工作电极浸入HAuCl4溶液中，经电化学沉积得到AuNPs修饰的工作电极；S2、在S1所得的工作电极上滴涂MUA，使MUA通过Au–S键组装到S1所得的工作电极上；S3、在S2所得的工作电极上滴涂含有N羟基琥珀酸亚胺和1-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的混合溶液，激活MUA的羧基；S4、在S3所得的工作电极上滴涂AuNPs-抗IAA复合物，得到IAA抗体修饰的工作电极；S5、在S4所得的工作电极上滴涂K3Fe(CN)6媒介体。2.根据权利要求1所述的微电极生物传感器，其特征在于，所述微电极生物传感器中工作电极的制备方法包括如下步骤：S1、将金工作电极或铂工作电极浸入含0.5～1MKNO3的2-5mMHAuCl4溶液中，在工作电极上-0.4V电化学沉积200s得到AuNPs修饰的工作电极；S2、在S1所得的工作电极上滴涂1～5mMMUA，孵育1～2h后用水冲去多余未反应的MUA，使MUA通过Au–S键组装到S1所得的工作电极上；S3、在S2所得的工作电极上滴涂含有N羟基琥珀酸亚胺和1-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的混合溶液，孵育1-2h后，激活MUA的羧基；所述N羟基琥珀酸亚胺和1-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的混合溶液中N羟基琥珀酸亚胺与1-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的摩尔浓度比为1:1～1:4；S4、在S3所得的工作电极上滴涂AuNPs-抗IAA复合物，孵育1～4h得到IAA抗体修饰的工作电极；S5、在S4所得的工作电极上滴涂5～10mMK3Fe(CN)6媒介体。3.根据权利要求2所述的微电极生物传感器，其特征在于，所述微电极生物传感器中工作电极的制备方法包括如下步骤：S1、将金工作电极或铂工作电极浸入含1MKNO3的3mMHAuCl4溶液中，在工作电极上-0.4V电化学沉积200s得到AuNPs修饰的工作电极；S2、在S1所得的工作电极上滴涂2mMMUA，孵育1h后用水冲去多余未反应的MUA，使MUA通过Au–S键组装到S1所得的工作电极上；S3、在S2所得的工作电极上滴涂含有N羟基琥珀酸...
【专利技术属性】
技术研发人员：王晓冬，李爱学，李璇，王成，胡叶，侯佩臣，潘大宇，路文超，何璐璐，张晗，
申请(专利权)人：北京农业信息技术研究中心，
类型：发明
国别省市：北京;11
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