一种快速鉴定产生长素的植物内生细菌的方法技术

本发明专利技术属于微生物技术领域，涉及一种快速鉴定产生长素的植物内生细菌的方法；包括以下步骤：（1）培养基及显色液的配制：所用的培养基为含色氨酸浓度0.5-2g/L的改良的R2A分离鉴定培养基，生长素显色液为2mL的0.5M氯化铁溶液以及98mL的体积分数为25~35%的高氯酸混匀；（2）植物组织的预处理：用体积分数为70~75%的乙醇和5~8%的次氯酸钠溶液分别浸泡后，用蒸馏水冲洗；（3）产生长素内生细菌的鉴定；本发明专利技术将分离培养基与产生长素鉴定培养基改良整合，在培养基中添加生产生长素的前体色氨酸，在分离菌株后立即施用生长素显色液，在5~10min内快速辨别出产生长素的内生细菌；简化鉴定工序，操作方便，缩短时间，是一种能简单、快速、有效鉴定产生长素内生菌的方法。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于微生物
，特别涉及。
技术介绍
大量研宄证明有些植物内生细菌能够通过生物固氮、产生植物激素等方式，促进宿主植物对营养物质的吸收并促进宿主植物生长发育及其他生理活动((I) Ansari, M.ff., D.K.Trivedi, et al.(2013).A critical review on fungi mediated plantresponses with special emphasis to Piriformospora indica on improved product1nand protect1n of crops.Plant Phys1logy and B1chemistry 70: 403-410.； (2)Rout, Μ.E.and T.H.Chrzanowski (2009).The invasive Sorghum halepense harborsendophytic N2-fixing bacteria and alters soil b1geochemistry.Plant and Soil315(1-2): 163-172.;(3)Rout，M.E.，T.H.Chrzanowskij et al.(2013).BacterialEndophytes Enhance Competit1n by Invasive Plants.American Journal of Botany100(9): 1726-1737.； (4) Waqasj M.，A.L Khan, et al.(2012).Endophytic FungiProduce Gibberellins and Indoleacetic Acid and Promotes Host—Plant Growthduring Stress.Molecules 17(9): 10754-10773.)。因此，现如今，越来越多的学者开始分离筛选植物内生细菌，并研宄其生物功能。其中，能够产生促进植物生长的生长素的内生细菌受到包括农业在内众多研宄领域的关注。通常，对产生长素的植物内生菌进行筛选的方法需经过分离、纯化培养、再活化、发酵、显色鉴定等过程。其中从再活化、发酵到最后的混合显色鉴定，这个过程极其繁琐，中间需更换多次不同成分的培养基及复杂的取样步骤，而且此过程菌体生长缓慢，往往会消耗大量时间(约5~10天)。因此，传统的植物内生细菌产生长素菌株的筛选方法既繁琐又需耗费大量时间。那么，一种能够快速、有效地鉴定产生长素的植物内生菌的方法在农业生产及相关科学研宄中很有必要。本专利技术提出了一种简单直观且快速的鉴定产生长素的植物内生细菌的方法，有目的地将能产生生长素的植物内生菌快速分离鉴定出来，能够大大缩短其研宄周期、实验成本，使之能尽快被应用到农业作物等实际生产中，能有效提高作物产量，从而极大促进农业生产水平。
技术实现思路
本专利技术提出了，能在短时间内有效鉴定出产生长素的植物内生细菌。本专利技术具有针对性强、周期短的特点。本专利技术的技术方案通过以下方式实现的: ，包括以下步骤: (I)培养基及显色液的配制: 配制含有不同色氨酸浓度的改良的R2A分离鉴定培养基，具体配方如下:称取0.5 g酵母提取物、0.5 g胰蛋白胨、0.5 g酪蛋白酸水解物、0.5 g葡萄糖、0.5 g可溶性淀粉、0.3 g磷酸二氢钾、0.024 g无水硫酸镁、0.3 g丙酮酸钠、15 g琼脂粉、0.5~2 g色氨酸，用双蒸水定容至I L，并调pH至7.2，配成改良的R2A分离鉴定培养基，经115 °〇高压灭菌15 min后，分装倒入9 cm的无菌培养皿中，冷却备用。配制生长素显色液:2 mL的0.5 M氯化铁溶液以及98 mL的体积分数为25~35%的高氯酸充分混匀。( 2 )植物组织的预处理: 选取生长良好的植物组织用蒸馏水冲洗干净后，置于无菌操作台中进行植物组织的表面消毒。由于消毒溶液浓度不够或者消毒时间较短，不能完全杀死植物组织表面的微生物，从而影响内生细菌的筛选；而浓度过高或时间太长，则容易损坏植物组织甚至是杀死植物内生菌，因此，我们选用体积分数为70~75%的乙醇浸泡消毒约I min，并不断搅拌，倒掉乙醇，加入体积分数为5~8%的次氯酸钠溶液浸泡约6~10 min,并不断震荡，倒掉次氯酸钠溶液，用灭菌蒸馏水冲洗约5次，置于无菌培养皿中，用剪刀将植物组织边缘剪去，露出新鲜切口，并将切口贴在已倒好的改良R2A分离鉴定培养基上。将培养皿封口放入30 °C的培养箱中暗培养。(3)产生长素的内生细菌的分离与快速鉴定: 将植物组织切口附近生长出的单一植物内生细菌菌落标上序号，用接种环蘸取不同序号菌体，用划线培养法得到单菌落；之后在长内生细菌的植物组织切口周围喷施生长素显色液，在30 V中进行暗反应，观察周围有粉红色物质产生的菌落，此即是可产生长素的内生细菌。本专利技术的有益效果: 本专利技术提供的产生长素的植物内生细菌的分离方法，可以快速、直观、有效鉴定出产生长素的内生细菌。传统的产生长素的植物内生细菌的分离鉴定方法需经历分离、纯化培养、再活化、发酵以及显色鉴定等过程，菌株分离纯化与菌株产生长素能力鉴定两部分被分割进行，即使除去分离纯化步骤，菌株产生长素能力的鉴定步骤仍需耗费约5~10天。而本专利技术将分离培养基与产生长素鉴定培养基进行改良整合，在培养基中添加了生产生长素的前体一一色氨酸，并且在分离菌株后立即采用喷施法施用生长素显色液(传统方法需先对菌株进行发酵，之后对发酵液进一步处理后，才与显色液混合反应)，一旦有内生细菌在培养过程分泌生长素，则显色液可迅速与之发生颜色反应，能在5~10 min内快速辨别出能产生长素的内生细菌。本专利技术在菌株分离纯化的基础上，同时可进行菌株产生长素能力的鉴定，极大简化了菌株产生长素能力的鉴定工序，最后菌株产生长素能力的鉴定步骤仅在5~10 min内即可完成。相比传统的分离鉴定方法，本方法不仅由于简化了鉴定工序而使得操作更为方便，也极大缩短了时间(仅大概为传统鉴定方法所用时间的0.1%)，还因此可以减少相应的实验成本。所以，本专利技术是一种能简单、快速、有效地对产生长素内生细菌进行鉴定的方法。【附图说明】图1为产生长素内生细菌的快速筛选结果，其中(a)为植物内生细菌的生长；(b)为分泌生长素的内生细菌经显色后可在周围形成红色物质。具体实施方法 下面根据具体实施例和附图内容对本专利技术更好的说明，以便本领域技术人员更好的理解本专利技术的技术方案。实施例1: (I)培养基及显色液的配制 配制含有0.05%色氨酸的改良的R2A分离鉴定培养基，具体配方如下:称取0.5 g酵母提取物、0.5 g胰蛋白胨、0.5 g酪蛋白酸水解物、0.5 g葡萄糖、0.5 g可溶性淀粉、0.3 g磷酸二氢钾、0.024 g无水硫酸镁、0.3 g丙酮酸钠、15 g琼脂粉、0.5 g色氨酸，用双蒸水定容至I L，并调pH至7.2，配成改良的R2A分离鉴定培养基，经115 °〇高压灭菌15 min后，分装倒入9 cm的无菌培养皿中，冷却备用。配制生长素显色液:2 mL的0.5 M氯化铁溶液以及98 mL的体积分数为25%高氯酸充分混匀。(本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种快速鉴定产生长素的植物内生细菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）培养基及显色液的配制：配制含有不同色氨酸浓度的改良的R2A分离鉴定培养基和生长素显色液；其中改良的R2A分离鉴定培养基每1L含0.5~2g色氨酸；（2）植物组织的预处理：选取生长良好的植物组织用蒸馏水冲洗干净后，置于无菌操作台中进行植物组织的表面消毒；然后用剪刀将植物组织边缘剪去，露出新鲜切口，并将切口贴在已倒好的改良R2A分离鉴定培养基上，将培养皿封口放入30 ℃的培养箱中暗培养；（3）产生长素的内生细菌的分离与快速鉴定：将植物组织切口附近生长出的单一植物内生细菌菌落标上序号，用接种环蘸取不同序号菌体，用划线培养法得到单菌落；之后立即在长内生细菌的植物组织切口周围喷施生长素显色液，在30 ℃中进行暗反应，观察周围有粉红色物质产生的菌落，此即是可产生长素的内生细菌。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：戴志聪，付伟，祁珊珊，王晓莹，蔡红红，肖翔，杜道林，
申请(专利权)人：江苏大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32