耐镉产铁载体菌株的分离方法及应用技术

本发明专利技术属于土壤治理技术领域，涉及一种耐镉产铁载体菌株的分离方法及应用。分离方法为：取黑麦草植株，抖落黑麦草根系周围的土壤后，剩下紧密附着在根系上的根际土壤，将根际土壤取下，加无菌水，震荡后静置，吸取上层土壤悬液，涂布于LB+2mg/L Cd

【技术实现步骤摘要】
耐镉产铁载体菌株的分离方法及应用
本专利技术属于土壤治理
，涉及一种耐镉产铁载体菌株的分离方法及应用。
技术介绍
治理土壤重金属污染一直是国内外面临的巨大挑战。植物修复因其低成本、无污染、不对土壤造成二次影响、操作简单等特点在众多的土壤重金属修复技术中脱颖而出。然而用于植物修复的大部分超富集植物存在生物量小、生长缓慢、对重金属具有选择性等缺点限制了植物修复技术的发展与应用。近年来，植物根际促生菌的深入研究为解决这一难题提供了新的思路。植物根际促生菌(PGPR)指生存于植物根际且有利于植物生长的微生物的总称。其中有一类能够产铁载体(Siderophore)的根际细菌，产生的铁载体既能给植物提供铁营养，又能与其他重金属结合，形成利于植物吸收的重金属-铁载体螯合物，增加植物对重金属的富集和吸收，提高植物修复效率。产铁载体细菌在植物修复中的作用主要体现为以下几个方面：(1)为植物提供足量的铁营养，缓解植物因缺铁引起的各种症状；(2)影响土壤中重金属生物有效性，分泌一些有机酸和铁载体直接或间接地活化土壤中的重金属，提高其生物可利用性；(3)产生植物生长调节物质，如3-吲哚乙酸(IAA)、细胞分裂素和赤霉素等[6]，这些物质在促进植物生长的同时也间接提高了其对重金属的吸收；(4)协助植物获得足量的营养元素，如氮、磷、钾等，以保证植物在逆境条件下的最佳生长条件；(5)生防机制，通过抢占植物根系表面的有利生态位点与病原菌竞争营养(如铁元素)；某些细菌还能通过产生抗生素的方式来抑制各种病原微生物的侵染。中国专利文献公开了一株新的巨大芽孢杆菌及其应用[申请号：201610081336.4]，保藏号：CCTCCNO：M2016033的巨大芽孢杆菌JD4(BacillusmegateriumJD4)，菌体生长快、酶系丰富，具有良好的产蛋白酶活力，其蛋白酶水解能力(Up)为83.60±4.84，远远高于已报道的同种菌株，能够高效降解有机物，在生物有机肥、饲料添加剂、水质改良剂领域具有较好的应用前景。目前，已有相当一部分具有促生效果的细菌从土壤中分离得到，并应用于重金属污染土壤的微生物-植物联合修复中。然而，在此过程中仍存在着两个问题，一是大部分促生细菌并非从修复植物本身获得，这可能造成菌株难以在植物体内定殖，也有可能因引进外来微生物资源对当地生态环境造成影响。二是多数研究只是寻求功能单一的促生细菌，而对于促生功能全面、环境适应能力强的土著促生细菌的报道相对较少。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对上述问题，提供一种耐镉产铁载体菌株的分离方法及应用。为达到上述目的，本专利技术采用了下列技术方案：一种耐镉产铁载体菌株的分离方法，其特征在于，取黑麦草植株，抖落黑麦草根系周围的土壤后，剩下紧密附着在根系上的根际土壤，将根际土壤取下，加无菌水，震荡后静置，吸取上层土壤悬液，涂布于LB+2mg/LCd2+的固体培养基平板上，恒温倒置培养2-5d，挑取生长良好的单菌落划线纯化，得到耐镉产铁载体菌株。在上述的耐镉产铁载体菌株的分离方法中，所述的根基土壤与无菌水的重量比为1:10，根基土壤加无菌水后，在150r/min振荡30min后静置10min，吸取上层土壤悬液，涂布于LB+2mg/LCd2+的固体培养基平板上，25-30℃倒置培养3-4d，挑取生长良好的单菌落划线纯化，得到耐镉产铁载体菌株，-80℃及以下温度保存。在上述的耐镉产铁载体菌株的分离方法中，所述的根基土壤与无菌水的重量比为1:10，根基土壤加无菌水后，在150r/min振荡30min后静置10min，吸取上层土壤悬液1mL，10倍系列稀释，依次制备若干不同稀释度的悬液，各取100μL涂布于LB+2mg/LCd2+的固体培养基平板上，28℃倒置培养3d，挑取生长良好的单菌落划线纯化，得到耐镉产铁载体菌株，-80℃及以下温度保存。本专利技术涉及按分离方法得到的菌株对提高镉胁迫下黑麦草种子发芽率的应用。本专利技术涉及按分离方法得到的菌株对土壤溶磷的应用。本专利技术涉及按分离方法得到的菌株在土壤中产铁载体的应用。本专利技术涉及按分离方法得到的菌株对植物促生的应用。本专利技术涉及按分离方法得到的菌株在镉污染土壤的修复中的应用。本专利技术涉及按分离方法得到的菌株对土壤中镉的活化的应用。本专利技术涉及按分离方法得到的菌株对土壤中铜的活化的应用。与现有技术相比，本专利技术的优点在于：1、本专利技术直接从修复植物黑麦草根际土壤中筛选功能较为全面的细菌，对其进行菌种鉴定与生物学特性研究，可为植物修复技术的开发提供优质的菌种资源。2、多年生黑麦草(LoliumperenneL.)是禾本科中产量较高的一种牧草，被广泛引种栽培，其具有环境适应性强、能耐受多种重金属的毒害、生长速度快、分蘖力强、生物量大等优点，因此黑麦草十分适合用作重金属污染植物修复材料。3、本专利技术从黑麦草根际土壤中分离到镉具有较强耐性的产铁载体菌株，根据生理生化及分子鉴定实验将其鉴定为巨大芽孢杆菌(B.megaterum.)。该菌株属于高产铁载体细菌，同时具备多种植物促生特性，能够分泌IAA，在LB培养液中培养48h后分泌IAA量达到26.5mg/L；在NBRIP培养液中，菌株对磷酸三钙的转化量达到96.3mg/L。在土壤中加入菌株的上清液能够显著提高其中镉的生物有效性，且种子萌发实验表明，接种菌株能使在Cd2+胁迫下的黑麦草种子的发芽率明显提高。综合各项促生能力以及菌株表现出的良好环境耐受性和适应性，可以发现菌株十分全面，在众多的促生细菌里具备相当的竞争力。综上，表明本专利技术分离得到的菌株具有良好的植物促生潜力及应用于微生物-植物联合修复重金属污染土壤的价值。附图说明图1为本专利技术提供的菌株LY02扫描电镜细胞形态(11000×)。图2为本专利技术提供的菌株LY02基于16SrDNA序列构建的系统发育树。图3为本专利技术提供的LY02菌悬液对不同浓度镉胁迫黑麦草种子发芽率的影响。具体实施方式下述实施例中所用的试剂，如无特殊说明，可以从常规生化试剂商店购买得到。以下实施例中的定量数据，均设置三次重复实验，结果取平均值。试验所需的试剂的制备方法如下：(1)LB培养基：胰蛋白胨10.0g，酵母提取物5.0g，NaCl10.0g，琼脂20.0g，蒸馏水1000mL，pH7.0，121℃、20min高压蒸汽灭菌；(2)SMA培养基：蔗糖20.0g，L-天冬氨酸2.0g，K2HPO40.5g，MgSO4·7H2O0.5g，8-羟基喹啉，蒸馏水1000mL，pH7.0，121℃、15min高压蒸汽灭菌；(3)无机磷培养基(NBRIP):葡萄糖10g，(NH4)2SO40.5g，NaCl0.3g，KCl0.3g，MgSO4·7H2O0.3g，Ca3(PO4)25g，蒸馏水1000mL，pH7.0-7.5，121℃、15min高压蒸汽灭菌；(4)Salkowski’S显色剂：150mL浓硫酸溶于250mL去离子水中，加入7.5mL0.5molL-1的FeCl3·6H2O溶液；(5)CAS检测液：将0.079gCAS溶于50mL去离子水中，再加入10mL1mmolL-1FeCl3溶液(用盐酸配制)，得溶液A。将0.069g十六烷基三甲基溴化铵(HDTMA)溶于40mL的去离子水中，得溶液B。将A本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种耐镉产铁载体菌株的分离方法，其特征在于，取黑麦草植株，抖落黑麦草根系周围的土壤后，剩下紧密附着在根系上的根际土壤，将根际土壤取下，加无菌水，震荡后静置，吸取上层土壤悬液，涂布于LB+2mg/L Cd

【技术特征摘要】
1.一种耐镉产铁载体菌株的分离方法，其特征在于，取黑麦草植株，抖落黑麦草根系周围的土壤后，剩下紧密附着在根系上的根际土壤，将根际土壤取下，加无菌水，震荡后静置，吸取上层土壤悬液，涂布于LB+2mg/LCd2+的固体培养基平板上，恒温倒置培养2-5d，挑取生长良好的单菌落划线纯化，得到耐镉产铁载体菌株。2.根据权利要求1所述的耐镉产铁载体菌株的分离方法，其特征在于，所述的根基土壤与无菌水的重量比为1:10，根基土壤加无菌水后，在150r/min振荡30min后静置10min，吸取上层土壤悬液，涂布于LB+2mg/LCd2+的固体培养基平板上，25-30℃倒置培养3-4d，挑取生长良好的单菌落划线纯化，得到耐镉产铁载体菌株，-80℃及以下温度保存。3.根据权利要求1所述的耐镉产铁载体菌株的分离方法，其特征在于，所述的根基土壤与无菌水的重量比为1:10...

【专利技术属性】
技术研发人员：林海萍，赵树民，虞方伯，郭恺，王勇军，张心齐，张昕，
申请(专利权)人：浙江农林大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33