NY-ESO-1有作为增强Art v1(wtArt)过敏原免疫反应分子佐剂的作用制造技术

本发明专利技术涉及生物医药领域，特别是涉及NY-ESO-1有作为增强Art v1(wtArt)过敏原免疫反应分子佐剂的作用。本发明专利技术发明专利技术人探索了NY-ESO-1蛋白甚至在存在有常规浓度的β-巯基乙醇的loading buffer中也能形成多聚结构；NY-ESO-1的聚合反应由其分子间的二硫键介导； NY-ESO-1在体外与人的及鼠的未成熟的树突细胞结合与其自身的聚合结构有关；TLR4影响了NY-ESO-1与骨髓中DC细胞的体外结合；NY-ESO-1与人和鼠的未成熟的树突细胞结合还可通过钙网蛋白的作用；聚合物低聚化减少了TLR4与NY-ESO-1的结合量；免疫球抗体反应由NY-ESO-1的聚合体结构和宿主体内的TLR4参与；Art v1(wtArt)和CA9基因免疫原性的提高依赖于NY-ESO-1基因融合表达。证实了NY-ESO-1有作为增强Art v1(wtArt)过敏原免疫反应分子佐剂的作用。

NY-ESO-1 acts as a molecular adjuvant for enhancing the immune response to Art, V1 (wtArt) allergen

The present invention relates to the field of biomedicine, in particular to NY-ESO-1 as Art V1 (wtArt) enhanced immune responses to allergens molecular adjuvant effect. The inventor of the invention to explore the NY-ESO-1 protein and even conventional concentration in the presence of mercaptoethanol loading buffer can form multimeric structure; two disulfide bond mediated polymerization of NY-ESO-1 by the intermolecular guide; NY-ESO-1 in vitro and the immature dendritic cells and rat based on polymeric structure with the effect of TLR4 combined with DC; NY-ESO-1 cells and bone marrow in vitro; immature NY-ESO-1 rat and human dendritic cell binding but also by calreticulin; polymer oligomerization reduces the combination of TLR4 and NY-ESO-1; immunoglobulin antibody reaction by the host and participate in the polymer structure of NY-ESO-1 TLR4; Art V1 (wtArt) CA9 gene and improve the immunogenicity of NY-ESO-1 dependent gene fusion expression. Confirmed the NY-ESO-1 as V1 (wtArt) Art enhanced immune responses to allergens molecular adjuvant effect.

【技术实现步骤摘要】
NY-ESO-1有作为增强Artv1(wtArt)过敏原免疫反应分子佐剂的作用
本专利技术涉及生物医药领域，特别是涉及NY-ESO-1有作为增强Artv1(wtArt)过敏原免疫反应分子佐剂的作用。
技术介绍
据推断，最开始对于肿瘤特异性抗原（TAA）的自身免疫应答反应可能有先天性免疫系统受体的参与。坏死肿瘤细胞会释放内源性因子或是例如热休克蛋白，高迁移率族蛋白B1（HMGB-1），尿酸这样的损伤相关模式分子。这些损伤模式分子分别通过CD91，晚期糖基化终末产物受体，TLR2/TLR4，以及白介素-1（IL-1）受体向先天免疫系统发出警报。TAA本身通常被认为是上述“危险信号”的旁观者，担任抗肿瘤免疫应答反应起始阶段的佐剂。根据这个例子可以说明，自发的免疫反应是由于存在于癌细胞中11000个基因突变而产生的新肽所引起的。然而，迄今为止，所发现的人类的TAA通常是非突变的自身蛋白。我们因此推断，来自于一些已知的TAA的内在因子也可能在体内最初阶段的抗肿瘤免疫应答反应中发挥着作用。在寻找那些宿主和肿瘤中有助于促成抗肿瘤的免疫反应的内在因子的过程中，我们将关注点放在了NY-ESO-1身上。NY-ESO-1是一种具有超强免疫原性的非突变肿瘤睾丸抗原。针对于NY-ESO-1的自发性抗体以及T细胞免疫反应能够在患有NY-ESO-1表达的肿瘤病人身上常常检测的到，这些病人包括那些免疫能力低的癌症晚期的老年患者。此外，自发性NY-ESO-1抗原在黑色素瘤中的减少，表明了抗NY-ESO-1的免疫反应可能会影响肿瘤的自然史。与其他TAA相比，NY-ESO-1的免疫原性不是由于其更高的表达水平。事实上，至少在黑色素肿瘤中的NY-ESO-1的表达水平要显著低于黑色素细胞分化抗原，如gp100，MART-1，TRP-1和TRP-2，，以及其他的肿瘤/睾丸抗原，如基于新鲜肿瘤样本实时定量PCR分析的MAGE-1和MAGE-3。我们最近研究了NY-ESO-1与在不成熟的树突细胞，巨噬细胞，单核细胞表面上补体Cq1受体（在文献中被视为等同于钙网织蛋白）间特殊的联系，从而说明了NY-ESO-1与先天性免疫系统之间的特异性相互作用。在这篇文章中，说明了NY-ESO-1的免疫原性，与它自身的聚合结构以及小鼠体内中的TLR4有关。
技术实现思路
据推断，最开始对于肿瘤特异性抗原（TAA）的自身免疫应答反应可能有先天性免疫系统受体的参与。坏死肿瘤细胞会释放内源性因子或是例如热休克蛋白，高迁移率族蛋白B1（HMGB-1），尿酸这样的损伤相关模式分子。这些损伤模式分子分别通过CD91，晚期糖基化终末产物受体，TLR2/TLR4，以及白介素-1（IL-1）受体向先天免疫系统发出警报。TAA本身通常被认为是上述“危险信号”的旁观者，担任抗肿瘤免疫应答反应起始阶段的佐剂。在寻找那些宿主和肿瘤中有助于促成抗肿瘤的免疫反应的内在因子的过程中，我们将关注点放在了NY-ESO-1身上。NY-ESO-1是一种具有超强免疫原性的非突变肿瘤睾丸抗原。针对于NY-ESO-1的自发性抗体以及T细胞免疫反应能够在患有NY-ESO-1表达的肿瘤病人身上常常检测的到，这些病人包括那些免疫能力低的癌症晚期的老年患者。但NY-ESO-1作为免疫分子佐剂的作用未清楚。鉴于以上所述现有技术，本专利技术第一方面提供NY-ESO-1蛋白甚至在存在有常规浓度的β-巯基乙醇的loadingbuffer中也能形成多聚结构。相关数据显示，从细菌及哺乳动物细胞中获得的NY-ESO-1蛋白甚至在存在有常规浓度的β-巯基乙醇的loadingbuffer中也能形成多聚结构（图1A,B）。本专利技术第二方面提供NY-ESO-1的聚合反应由其分子间的二硫键介导。相关实验显示，NY-ESO-1野生型蛋白清楚的显示出了存在二聚体，四聚体甚至130kDa的多聚体的形式。ESOcs1、ESOcs2显示出的主要为单体及二聚体结构形式，而ESOcs3的结果显示出主要为单体。说明NY-ESO-1的聚合反应是由于其分子间的二硫键造成的。本专利技术第三方面提供NY-ESO-1在体外与人的及鼠的未成熟的树突细胞结合与其自身的聚合结构有关。相关数据显示，NY-ESO-1野生型蛋白清楚的显示出了存在二聚体，四聚体甚至130kDa的多聚体的形式。ESOcs1、ESOcs2显示出的主要为单体及二聚体结构形式，而ESOcs3的结果显示出主要为单体。在癌细胞中存在的NY-ESO-1，同样采用Westernblot分析其在含有常规浓度的β-巯基乙醇的loadingbuffer中蛋白聚合情况，发现NY-ESO-1主要表现为三聚体及四聚体，很少发现存在二聚体及单体形式的现象（突变1C）。表明NY-ESO-1在体外与人的及鼠的未成熟的树突细胞结合是与其自身的聚合结构有关的。本专利技术第四方面提供TLR4影响了NY-ESO-1与骨髓中DC细胞的体外结合。我们分别采用了从野生型小鼠及TLR4和TLR2基因敲除的小鼠骨髓中提取出来的树突细胞来进行NY-ESO-1的结合实验，从而进行对比。结果显示出了TLR4主要影响了NY-ESO-1与骨髓中DC细胞的体外结合，而TLR2则没有显著的影响（图2A）。作为NY-ESO-1与TLR4之间直接联系的证据，显示，鼠的TLR4与野生型NY-ESO-1聚合物及钙网蛋白形成明显的高分子聚合物一起沉淀下来（图2C）。与全细胞裂解液中的情况相比，这些高分子聚合物所包含的多聚体NY-ESO-1并不是以单体或者低分子量的结构域与CRT和TLR4移动结合的。随着聚合物的越来越低聚化，TLR4与NY-ESO-1的结合量也随之减少(图2D)。这些实验结果为NY-ESO-1能够与人、鼠的树突细胞结合是通过细胞表面的TLR4这一结论提供了依据。本专利技术第五方面提供NY-ESO-1与人和鼠的未成熟的树突细胞结合还可通过钙网蛋白的作用。实验采用了从野生型小鼠及TLR4和TLR2基因敲除的小鼠骨髓中提取出来的树突细胞来进行NY-ESO-1的结合实验，从而进行对比。结果显示出了TLR4主要影响了NY-ESO-1与骨髓中DC细胞的体外结合，而TLR2则没有显著的影响（图2A）。因为NY-ESO-1与人和鼠的未成熟的树突细胞结合还通过了钙网蛋白的作用。本专利技术第六方面提供聚合物低聚化减少了TLR4与NY-ESO-1的结合量。相关数据显示，随着聚合物的越来越低聚化，TLR4与NY-ESO-1的结合量也随之减少(图2D)。实验结果表明聚合物低聚化减少了TLR4与NY-ESO-1的结合量。本专利技术第七方面提供免疫球抗体反应由NY-ESO-1的聚合体结构和宿主体内的TLR4参与。相关数据显示，ESOcs1的引起的抗体的效价有某些程度上的减弱，然而ESOcs2，ESOcs3所引起的抗体其效价几乎检测不到。在TLR4基因敲除的小鼠中（图3B），由野生型质粒所编码诱导的NY-ESO-1抗体的效价也有明显的减弱，而β-gal特异性抗体的效价始终与在野生型小鼠中保持一致。表明NY-ESO-1抗体反应的TLR4依赖性。在抗体效价测定中显示，在野生型小鼠中NY-ESO-1聚合体结果突变（半胱氨酸-丝氨酸替换）与抗体效价有某些联系，但是在TLR4基因敲除的小鼠中，这种联系没有体现出来，例本文档来自技高网...

【技术保护点】
NY‑ESO‑1有作为增强Art v1(wtArt)过敏原免疫反应分子佐剂的作用。

【技术特征摘要】
1.NY-ESO-1有作为增强Artv1(wtArt)过敏原免疫反应分子佐剂的作用。2.如权利要求1所述NY-ESO-1有作为增强Artv1(wtArt)过敏原免疫反应分子佐剂的作用，其中所涉及的动物模型是C57BL/10与C57BL/10ScNJ(TLR4-/-)小鼠。3.如权利要求1所述NY-ESO-1有作为增强Artv1(wtArt)过敏...

【专利技术属性】
技术研发人员：田晓丽，
申请(专利权)人：宁波美丽人生医药生物科技发展有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33