一种生防菌挥发性代谢物的检测方法技术

本发明专利技术公开了一种生防菌AR30挥发性代谢物的检测方法，包括：(1)将细菌发酵液涂布于培养基上，所述培养基置于顶空瓶中；(2)采用固相微萃取技术收集细菌挥发物；(3)用配置多模式进样口的气相色谱‑质谱联用仪，在全扫描模式下结合商业谱库检索和正构烷烃保留指数匹配的方式对细菌挥发物进行鉴定，根据化合物分子鉴定结果，对细菌挥发物含量进行定量分析。该方法能够有效解决不稳定、易降解的活性挥发物的收集、鉴定及定量检测问题，掌握细菌胞外挥发性代谢物分子时空动态信息，为研究生防菌的抗菌机理、作用方式及其在生物防治领域中的应用提供支持，为丰富抗菌物质种类和挖掘新的抗菌基因提供理论基础。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于活性代谢物检测
，涉及一种生防菌挥发性代谢物的检测方法。
技术介绍
本专利技术所涉及的生防菌AR03是从土壤根际细菌中筛选出一株性状良好的细菌菌株，经鉴定为短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)，该菌株及其在植病生防中的应用已获得国家专利技术专利(ZL.201110146683.8)。该菌株对果蔬作物青枯病菌(RalostoniaSolanacearum)、烟草赤星病菌(Alternariaalternata)、烟草黑胫病菌(Phytophoranicotianae)、烟草炭疽病菌(ColletotrichumnicotianaeAv.-Sacca)和烟草白粉病(ErysiphecichoracearumDC)等多种植物病原真菌和细菌有明显的抑制作用；另外AR03菌株对烟株还具有促生作用，在灭菌土条件下，经AR03处理后的整株干重和根干重比对照增加121.8％和176.7％；在自然土条件下，整株干重和根干重比对照增加了17.2％和14.4％。生防细菌对植物病原真菌病害的防病机制，主要包括抗生竞争诱导抗性及寄生等多种方式，其中通过分泌胞外代谢物抑制病原的生长和代谢是抗生作用的主要方式。因此，验证菌株拮抗活性的重要指标是该菌株的发酵上清液具有抑菌作用，即抗菌活性物质的提取是通过生防菌株的发酵滤液来完成。在研究该菌株对植物病原真菌和细菌拮抗作用的过程中发现，不同浓度AR03菌悬液(发酵原液、稀释30倍、100倍、200倍)对真菌菌丝形态，分生孢子萌发表现出较强的抑制作用，但其除菌上清液无抑菌活性。因此我们初步判断该菌株产生的具备抑菌活性的胞外代谢物不是存在于菌液中，而是以挥发态存在。对该菌株胞外挥发性抗菌物质进行鉴定和定量分析，对于进一步研究AR03菌株对病原菌的抗菌机理、作用方式及其田间防治提供支持，为丰富抗菌物质种类和挖掘新的抗菌基因提供理论基础。目前，挥发性有机物的收集方式主要有液液萃取(LLE)、水蒸气蒸馏(SD)、同时蒸馏萃取(SDE)、热脱附(TD)、吹扫捕集(P&D)、超临界萃取(SFE)、固相微萃取(SPME)等，其中LLE、SD、SDE是传统的提取方法，对人员、仪器配置要求不高，是挥发性成分收集的常用方法，但这些传统方法通常需要耗费较长的提取时间、大量的溶剂和繁琐的操作过程，此外高温的蒸馏过程会导致许多热不稳定的挥发性有机物降解，测的结果不能反映目标物的真实组成。而TD、P&T、SFE这三种提取方式均需要专门的设备，对人员和仪器配置要求都较高，且不太适用于痕量挥发性有机物的收集。SPME是近年来应用较为广泛的一种样品前处理技术，它的发展就是为了适应实验室和现场样品的快速处理的需求，其操作通常将少量具有吸附功能的涂层材料固定于基质表面，直接或间接接触样品，然后进行脱附分析。传统的分析方法和样品预处理技术存在的缺点固相微萃取技术几乎都能克服，该技术集取样萃取浓缩于一体，无需溶剂，具有快速高效成本低安全性高，能够与其他仪器联用等众多优点，使得样品处理技术及分析操作简单省时，因此成为目前最常用应用最广泛的样品预处理方法之一。近几年有大量的SPME研究论文出现，其中应用最多的是食品分析领域，在细菌挥发性代谢物研究方面还处于刚刚起步阶段。细菌挥发性代谢产物是细菌代谢产物的重要组成部分，与细菌生命活动和细菌生长数量密切关联，其中大多具有抑菌活性的代谢物质是细菌生命活动的中间产物，易被氧化、降解和发生分子重排。而现有针对微生物挥发性产物研究方法中，大多对于实验条件的控制不够严格，不适合于稳定性差的活性物质的分析，且定量分析过程大都采用峰面积归一化法，以各挥发性代谢物的峰面积占总峰面积之比值表示代谢物的相对含量，不能准确反映样品中目标代谢物真实组成情况。
技术实现思路
针对现有技术的不足，本申请提供一种生防细菌挥发性代谢物鉴定与定量分析于一体的活体、实时、无损检测方法。该方法能够有效解决不稳定、易降解的活性挥发物的收集、鉴定及定量检测问题，掌握细菌胞外挥发性代谢物分子时空动态信息，为研究生防菌的抗菌机理、作用方式及其在生物防治领域中的应用提供支持，为丰富抗菌物质种类和挖掘新的抗菌基因提供理论基础。为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案如下：一种生防菌挥发性代谢物的检测方法，包括：(1)将细菌发酵液涂布于培养基上，所述培养基置于顶空瓶中；(2)采用固相微萃取技术收集细菌挥发物；(3)用配置多模式进样口的气相色谱-质谱联用仪，在全扫描模式下结合商业谱库检索和正构烷烃保留指数匹配的方式对细菌挥发物进行鉴定，根据化合物分子鉴定结果，对细菌挥发物含量进行定量分析。具体的，一种生防菌挥发性代谢物的检测方法，包括如下步骤：(1)生防菌培养：取培养基倾倒于无菌顶空瓶中冷却凝固，取生防菌发酵液涂布于培养基表面，加盖密封；同时设置空白对照组，所述空白对照组不添加生防菌发酵液；(2)空白样品挥发物收集：将步骤(1)中获得的空白培养基的顶空瓶在室温中静置一定时间后，进行采样；采样时用铁架台固定萃取探针和顶空瓶，将SPME针管刺入顶空瓶，推动手柄杆使纤维头伸出针管。萃取头置于顶空瓶的上部空间；收集完毕后将萃取头收起，并将针管拔出样品瓶，待GC-MS分析；(3)细菌挥发物收集：将步骤(1)获得含生防菌的顶空瓶在室温中静置一定时间后，进行采样，采样前首先向顶空瓶侧壁注入1-十五烯内标溶液，注意尽量避免接触培养基基质，然后将SPME针管刺入顶空瓶，将萃取头置于顶空瓶上部空间，采集细菌挥发性代谢物，收集完毕后将萃取头收起，并将针管拔出样品瓶，待GC-MS分析；(4)吸附正构烷烃(C10-C20)萃取头制作：将正构烷烃(C10-C20)溶液于顶空瓶中，在室温中静置一定时间后，进行采样；将SPME针管刺入顶空瓶，推动手柄杆使纤维头伸出针管；萃取头置于样品的上部空间，采集气态正构烷烃；收集完毕后将萃取头收起，并将针管拔出样品瓶，待GC-MS分析；(5)挥发物定性分析：将步骤(2)、(3)获得含挥发物的探针以及步骤(4)吸附正构烷烃(C10-C20)的探针，在全扫描模式下进行分析，得到空白基质挥发物、细菌挥发性代谢物和正构烷烃(C10-C20)的总离子流图；(6)细菌挥发性代谢物鉴定：将步骤(5)获得细菌挥发物总离子流图，扣除空白样品挥发物总离子流图中共有色谱峰，即为挥发性代谢物特征指纹峰，经NIST和WILIY谱库对总离子图中化合物进行定性识别，对于识别的每种代谢物，根据其相邻正构烷烃的保留时间和碳原子数，计算该代谢物的保留指数(retentionindex)，然后查阅NISTChemistryWebBook中报道的该组分在相同色谱柱中的保留指数，与本文计算结果相比较，进一步验证谱库检索结果的准确性；(7)细菌挥发代谢物定量分析：将步骤(2)、(3)中获得含挥发性有机物的探针，进GC-MS分析，根据步骤(6)获得的挥发性代谢物的鉴定结果，以1-十五烯溶液作为内标参照，采用内标法计算各色谱峰对应代谢物的相对含量；优选的，所述生防菌为短小芽孢杆菌AR03，该菌已于2010年8月23日由中国微生物保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏，保藏编号为CGMCCNo.4117；优选的，步骤(1)和步骤(2)中所述培养基本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种生防菌挥发性代谢物的检测方法，其特征在于，检测方法为：(1)将细菌发酵液涂布于培养基上，所述培养基置于顶空瓶中；(2)采用固相微萃取技术收集细菌挥发物；(3)用配置多模式进样口的气相色谱‑质谱联用仪，在全扫描模式下结合商业谱库检索和正构烷烃保留指数匹配的方式对细菌挥发物进行鉴定，根据化合物分子鉴定结果，对细菌挥发物含量进行定量分析。

【技术特征摘要】
1.一种生防菌挥发性代谢物的检测方法，其特征在于，检测方法为：(1)将细菌发酵液涂布于培养基上，所述培养基置于顶空瓶中；(2)采用固相微萃取技术收集细菌挥发物；(3)用配置多模式进样口的气相色谱-质谱联用仪，在全扫描模式下结合商业谱库检索和正构烷烃保留指数匹配的方式对细菌挥发物进行鉴定，根据化合物分子鉴定结果，对细菌挥发物含量进行定量分析。2.如权利要求1所述的一种生防菌挥发性代谢物的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)生防菌培养：取培养基倾倒于无菌顶空瓶中冷却凝固，取生防菌发酵液涂布于培养基表面，加盖密封；同时设置空白对照组，所述空白对照组不添加生防菌发酵液；(2)空白样品挥发物收集：将步骤(1)中获得的空白培养基的顶空瓶在室温中静置一定时间后，进行采样；采样时用铁架台固定萃取探针和顶空瓶，将SPME针管刺入顶空瓶，推动手柄杆使纤维头伸出针管。萃取头置于顶空瓶的上部空间；收集完毕后将萃取头收起，并将针管拔出样品瓶，待GC-MS分析；(3)细菌挥发物收集：将步骤(1)获得含生防菌的顶空瓶在室温中静置一定时间后，进行采样，采样前首先向顶空瓶侧壁注入1-十五烯内标溶液，注意尽量避免接触培养基基质，然后将SPME针管刺入顶空瓶，将萃取头置于顶空瓶上部空间，采集细菌挥发性代谢物，收集完毕后将萃取头收起，并将针管拔出样品瓶，待GC-MS分析；(4)吸附正构烷烃(C10-C20)萃取头制作：将正构烷烃(C10-C20)溶液于顶空瓶中，在室温中静置一定时间后，进行采样；将SPME针管刺入顶空瓶，推动手柄杆使纤维头伸出针管；萃取头置于样品的上部空间，采集气态正构烷烃；收集完毕后将萃取头收起，并将针管拔出样品瓶，待GC-MS分析；(5)挥发物定性分析：将步骤(2)、(3)获得含挥发物的探针以及步骤(4)吸附正构烷烃(C10-C20)的探针，在全扫描模式下进行分析，得到空白基质挥发物、细菌挥发性代谢物和正构烷烃(C10-C20)的总离子流图；(6)细菌挥发性代谢物鉴定：将步骤(5)获得细菌挥发物总离子流图，扣除空白样品挥发物总离子流图中共有色谱峰，即为挥发性代谢物特征指纹峰，经NIST和WILIY谱库对总离子图中化合物进行定性识别，对于识别的每种代谢物，根据其相邻正构烷烃的保留时间和碳原子数，计算该代谢物的保留指...

【专利技术属性】
技术研发人员：曹建敏，王静，邱军，于卫松，林璎楠，孙娜，庞雪莉，
申请(专利权)人：中国农业科学院烟草研究所，
类型：发明
国别省市：山东;37