本发明专利技术公开了一种土壤真菌磷组分的31P NMR测定方法，该方法采用土壤悬液培养富集土壤真菌样品，真菌样品离心冻干后采用NaOH–EDTA浸提离心的方法将真菌中的磷浸提出来，得到真菌磷浸提液；部分浸提液用于真菌可浸提全磷含量测定，剩余浸提液冷冻干燥处理后，得到粉末样品；将冻干后的粉末用特定混合液重溶解后进行31P NMR上机测试，即可得到真菌磷组分的相关信息。本发明专利技术通过对土壤样品真菌富集培养，浸提并测定其磷组分，得到了土壤微生物磷组分测定的新方法，通过对土壤优势真菌磷组分和土壤磷组分的31P NMR谱图对比，对明确土壤微生物磷在土壤中的转化有重要意义。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及土壤微生物磷组分的浸提及测定，具体为一种土壤真菌磷组分的液体31PNMR测定方法。
技术介绍
磷(P)作为植物体能量转化(ATP)、细胞结构(磷脂)、新陈代谢和信号传导的中心物质，是植物生长发育所必需的一种营养元素，是所有有机生命体所必需的营养元素(Cade-Menunetal.,2006)。植物所需要的磷，多来源于其着生的土壤和外源磷肥的施入而土壤中的磷可分为有机磷和无机磷两大组分，其中有机磷占土壤全磷的50％～80％(Dalal,1977)。真菌构成了土壤的大部分微生物生物量，具有分解有机质，为植物提供养分的功能，因此，土壤真菌所含的磷代谢是土壤磷循环中的重要一环。土壤中磷化合物结构不同其水解为有效磷的难易程度不同。自1980年，Newman和Tate将31PNMR技术应用于土壤磷组分测定，目前，液体31PNMR技术发展成熟，可将土壤磷化合物细分为核酸类、磷脂类、肌醇磷酸酯类、磷酸酰胺类、磷蛋白类、磷酸糖类、膦酸酯类等(McKelvie,2005)。土壤微生物磷库是土壤有机磷的重要组成部分，而土壤中微生物磷组分的测定方法较少。目前微生物磷的测定，仅限于用熏蒸法结合钼蓝比色法测定土壤微生物量磷，因此，应用31PNMR技术，建立一种土壤微生物磷组分，特别是土壤真菌磷组分的浸提、测定方法，对于提高对土壤磷组分的认识，明确土壤微生物磷与土壤磷组分的转化关系，有重要的现实意义。
技术实现思路
本专利技术目的在于提供一种土壤真菌磷组分的液体31PNMR测定方法。首先从土壤样品中富集真菌样品，将样品冷冻干燥后浸提，浸提液离心后再次进行冷冻干燥，其后应用液体31PNMR技术进行磷组分测定。本专利技术为分析土壤微生物中磷组分特别是真菌磷组分的组成及含量，提供一种准确、高效的测定方法。为了实现上述目的，本专利技术采用的技术方案如下：一种土壤真菌磷组分的31PNMR测定方法，它包括以下步骤：1)土壤真菌样品的获取：将采集的土样过2mm筛，通过梯度稀释后的土壤悬液涂布于PDA培养基平板，30℃培养若干天，在菌丝长到平板60％面积时，准备土壤浸出液；将土壤浸出液加至500ml三角瓶中，并加入煮熟后的土豆滤液并称取2g葡萄糖、2g琼脂也加至三角瓶中制得培养液，培养液混合均匀后封口灭菌，灭菌后，在超净台将培养液迅速分装至灭菌的平板，冷却至培养液凝固，用平口刀割取1cm2左右于PDA培养基平板培养得到的菌种到上述每个平板，用封口膜封口，30℃恒温培养至菌丝长成，待菌丝长成后，用平口刀片在超净台内将平板上层菌丝刮下，用无菌水冲至广口瓶中，刮取完毕将富集的真菌样品冷冻干燥得到真菌样品冻干粉末，备用；2)土壤真菌磷组分的提取：将冻干后的真菌样品称取1.5g于50ml离心管，然后向其中加入30mlNaOH-EDTA溶液，在20℃条件下低速往复振荡16h，浸提液在10000×g下离心30min，吸取上清液混合后再次进行冷冻干燥得到土壤真菌磷组分冻干粉；3)土壤真菌磷的定量分析：取1ml步骤2)中未冷冻干燥前的上清液加4ml无菌水稀释后，采用ICP-MS测定真菌磷浸提液的全磷含量，用于谱图中量化分析不同磷化合物的含量；4)真菌磷组分的液体31PNMR测定：将步骤2)得到的土壤真菌磷组分的冻干粉末称取100mg重溶解于0.1mLD2O和0.9mL的1.0MNaOH与100mMNa2EDTA构成的缓冲液共同组成的混合溶液中，移入5mmNMR测试管中进行谱图测定，仪器采用500M核磁测定，延迟时间2.0s，采集时间0.4s，45度脉冲6μs，化学位移范围为50ppm，扫描次数3万次左右，即可获得土壤真菌磷组分的液体31PNMR谱图。所述步骤1)中的土壤浸出液是按照下述方法制备得到的：称取与待测土样相同的土样1g加100ml无菌水至120ml广口瓶，150rpm振荡30min，振荡结束后在8180rpm离心15min，吸取离心上清液即为土壤浸出液。所述步骤2)中NaOH-EDTA溶液为0.05M的Na2EDTA溶液和0.25M的NaOH溶液组成。本专利技术的有益效果是：1.本专利技术通过对土壤样品真菌富集培养，浸提并测定其磷组分，得到了土壤微生物磷组分测定的新方法，通过对土壤优势真菌磷组分和土壤磷组分的31PNMR谱图对比，对明确土壤微生物磷在土壤中的转化有重要意义。2.本专利技术通过土壤真菌样品的NaOH-EDTA浸提，增加了浸提液中各磷组分的浸提比例，为获取更详尽的土壤真菌磷组分谱图，了解土壤中的真菌磷组分创造了条件。3.本专利技术通过对真菌样品NaOH-EDTA浸提液的冷冻干燥，富集了真菌磷组分，为获取信噪比更好的土壤真菌磷组分谱图创造了条件。4.本专利技术通过对液体31PNMR测定时相关参数的确定，提高了真菌磷组分谱图的分辨率，增加了谱图解析时的准确性。附图说明图1是三种不同土壤优势真菌液体31PNMR谱图。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术做进一步的详细说明。实施例1本专利技术采用土壤悬液培养富集土壤真菌样品，真菌样品离心冻干后采用NaOH–EDTA浸提离心的方法将真菌中的磷浸提出来，得到真菌磷浸提液；部分浸提液用于真菌可浸提全磷含量测定，剩余浸提液冷冻干燥处理后，得到粉末样品；将干燥后的粉末用0.1mLD2O和0.9mL含1.0MNaOH和100mMNa2EDTA的缓冲液重溶解后进行31PNMR上机测试，即可得到真菌磷组分的相关信息。具体方法详述如下：1)土壤真菌样品的获取：取褐土秸秆还田后土样过2mm筛，将不同处理土壤通过梯度稀释后的土壤悬液涂布于PDA培养基平板，30℃培养若干天，在菌丝长到平板60％面积时，准备土壤浸出液；将土壤浸出液加至500ml三角瓶中，并加入煮熟后的土豆滤液并称取2g葡萄糖、2g琼脂也加至三角瓶中制得培养液，培养液混合均匀后封口灭菌，灭菌后，在超净台将培养液迅速分装至灭菌的平板，冷却至培养液凝固，用平口刀割取1cm2左右于PDA培养基平板培养得到的菌种到上述每个平板，用封口膜封口，30℃恒温培养至菌丝长成，待菌丝长成后，用平口刀片在超净台内将平板上层菌丝刮下，用无菌水冲至广口瓶中，刮取完毕将富集的真菌样品冷冻干燥得到真菌样品冻干粉末，备用；所述的土壤浸出液是按照下述方法制备得到的：称取与待测土样相同的土样1g加100ml无菌水至120ml广口瓶，150rpm振荡30min，振荡结束后在8180rpm离心15min，吸取离心上清液即为土壤浸出液。2)土壤真菌磷组分的提取：将冻干后的真菌样品称取1.5g于50ml离心管，然后向其中加入30mlNaOH-EDTA溶液，在20℃条件下低速往复振荡16h，浸提液在10000×g下离心30min，吸取上清液混合后再次进行冷冻干燥得到土壤真菌磷组分冻干粉；所述NaOH-EDTA溶液为0.05M的Na2EDTA溶液和0.25M的NaOH溶液组成。3)土壤真菌磷的定量分析：取1ml步骤2)中未冷冻干燥前的上清液加4ml无菌水稀释后，采用ICP-MS测定真菌磷浸提液的全磷含量，用于谱图中量化分析不同磷化合物的含量；4)真菌磷组分的液体31PNMR测定：将步骤2)得到的土壤真菌磷组分的冻干粉末称取100mg重溶解于0.1mLD2O和0.9mL的1.0MNaOH与100mMNa2EDTA构成的本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种土壤真菌磷组分的31P NMR测定方法，其特征在于，它包括以下步骤：1)土壤真菌样品的获取：将采集的土样过2mm筛，通过梯度稀释后的土壤悬液涂布于PDA培养基平板，30℃培养若干天，在菌丝长到平板60％面积时，准备土壤浸出液；将土壤浸出液加至500ml三角瓶中，并加入煮熟后的土豆滤液并称取2g葡萄糖、2g琼脂也加至三角瓶中制得培养液，培养液混合均匀后封口灭菌，灭菌后，在超净台将培养液迅速分装至灭菌的平板，冷却至培养液凝固，然后用平口刀割取1cm2左右于PDA培养基平板培养得到的菌种到上述每个平板，用封口膜封口，30℃恒温培养至菌丝长成，待菌丝长成后，用平口刀片在超净台内将平板上层菌丝刮下，用无菌水冲至广口瓶中，刮取完毕将富集的真菌样品冷冻干燥得到真菌样品冻干粉末，备用；2)土壤真菌磷组分的提取：将冻干后的真菌样品称取1.5g于50ml离心管，然后向其中加入30ml NaOH‑EDTA溶液，在20℃条件下低速往复振荡16h，浸提液在10000×g下离心30min，吸取上清液混合后再次进行冷冻干燥得到土壤真菌磷组分冻干粉；3)土壤真菌磷的定量分析：取1ml步骤2)中未冷冻干燥前的上清液加4ml无菌水稀释后，采用ICP‑MS测定真菌磷浸提液的全磷含量，用于谱图中量化分析不同磷化合物的含量；4)真菌磷组分的液体31P NMR测定：将步骤2)得到的土壤真菌磷组分的冻干粉末称取100mg重溶解于0.1mL D2O和0.9mL的1.0M NaOH与100mM Na2EDTA构成的缓冲液共同组成的混合溶液中，移入5mm NMR测试管中进行谱图测定，仪器采用500M核磁测定，延迟时间2.0s，采集时间0.4s，45度脉冲6μs，化学位移范围为50ppm，扫描次数3万次左右，即可获得土壤真菌磷组分的液体31P NMR谱图。...
【技术特征摘要】
1.一种土壤真菌磷组分的31PNMR测定方法，其特征在于，它包括以下步骤：1)土壤真菌样品的获取：将采集的土样过2mm筛，通过梯度稀释后的土壤悬液涂布于PDA培养基平板，30℃培养若干天，在菌丝长到平板60％面积时，准备土壤浸出液；将土壤浸出液加至500ml三角瓶中，并加入煮熟后的土豆滤液并称取2g葡萄糖、2g琼脂也加至三角瓶中制得培养液，培养液混合均匀后封口灭菌，灭菌后，在超净台将培养液迅速分装至灭菌的平板，冷却至培养液凝固，然后用平口刀割取1cm2左右于PDA培养基平板培养得到的菌种到上述每个平板，用封口膜封口，30℃恒温培养至菌丝长成，待菌丝长成后，用平口刀片在超净台内将平板上层菌丝刮下，用无菌水冲至广口瓶中，刮取完毕将富集的真菌样品冷冻干燥得到真菌样品冻干粉末，备用；2)土壤真菌磷组分的提取：将冻干后的真菌样品称取1.5g于50ml离心管，然后向其中加入30mlNaOH-EDTA溶液，在20℃条件下低速往复振荡16h，浸提液在10000×g下离心30min，吸取上清液混合后再次进行冷冻干燥得到土壤真菌磷组分冻干粉；3)土壤真菌磷的定量分析：取...
【专利技术属性】
技术研发人员：张广娜，林祥杰，徐树建，曹晓娟，董欣欣，
申请(专利权)人：临沂大学，
类型：发明
国别省市：山东;37
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