本发明专利技术公开了一种与老年性骨质疏松相关微小RNA的寡核苷酸化合物的应用，用于弥补基于微小RNA的寡核苷酸在制备促进成骨细胞功能、抑制老年性骨质疏松症化合物应用中的空缺。技术方案是筛选获得与老年性骨质疏松相关的微小RNA，通过合成基于与老年性骨质疏松相关微小RNA的寡核苷酸并转染至前成骨细胞和老年骨质疏松小鼠体内，结果显示可促进成骨细胞功能，并抑制老年性骨质疏松症的进展。本发明专利技术制备的基于与老年性骨质疏松相关微小RNA的寡核苷酸，可通过促进成骨细胞功能，抑制老年性骨质疏松症的程度，弥补了基于微小RNA的寡核苷酸在制备促进成骨细胞功能、抑制老年性骨质疏松化合物应用中的空缺。
Application of oligonucleotide compounds related to age-related osteoporosis associated with small RNA
The invention discloses an application associated with senile osteoporosis micro RNA oligonucleotides, small oligonucleotides based on RNA used to make up in preparation to promote bone cell function, inhibit the vacancy of senile osteoporosis compound application. The technical scheme is to obtain micro RNA associated with senile osteoporosis screening by oligonucleotide synthesis associated with senile osteoporosis and tiny RNA transfected into bone cells and in vivo before osteoporotic mice based on the results can promote osteoblast function, and inhibit the progression of senile osteoporosis. Oligonucleotides associated with senile osteoporosis based on micro RNA prepared by the invention can promote osteoblast function, inhibition of senile osteoporosis, to make up for the small oligonucleotides based on RNA in preparation to promote bone cell function, inhibit the vacancy of senile osteoporosis compound application.
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物医药工程领域，特别涉及一种与老年性骨质疏松相关微小RNA的寡核苷酸化合物的应用。
技术介绍
老年性骨质疏松是指随着年龄的增大，骨骼系统由于机能降低而引发的疾病，常表现为骨密度、骨量下降，骨微结构破坏，骨脆性增加易发骨折等。我国目前处于人口老龄化加速进程，2000年人口普查结果显示有50岁以上人口约2.6亿，占总人口的20.68％；而根据2010年的普查结果，50岁以上人口总数上升至约3.4亿，10年间增长了30.8％(国务院人口普查办公室.中国2010年人口普查资料[M].北京：中国统计出版社)。微小RNA是一类内源性的非编码RNA，可参与包括骨代谢在内的多种生理和病理学过程。众多研究表明微小RNA的表达水平与年龄和骨质疏松紧密相关，基于微小RNA核苷酸序列的寡核苷酸化合物可通过调控微小RNA的表达，促进成骨细胞功能、改善骨骼微结构并抑制骨质疏松程度，因此是潜在的骨质疏松症治疗药物靶点。第三军医大学窦策等专利技术了miR-18a-5p抑制剂在制备防治骨质疏松药物中的应用。该专利技术通过合成并转染miR-18a-5p的抑制剂miRNA inhibitor，下调破骨细胞分化过程中miR-18a-5p的表达，解除对LXR-b基因的靶向抑制作用，抑制破骨细胞分化，从而实现防治骨质疏松的目的。但是，该专利技术一方面未提供基于miR-18a-5p的抑制剂在成骨细胞中的数据，另一方面未对此抑制剂进行体内动物实验的验证(窦策，许建中，董世武.miR-18a-5p抑制剂在制备防治骨质疏松药物中的应用[P].北京：CN105288658A，20160203.)。第四军医大学杨安钢等专利技术了基于miR-494的抑制剂在制备抗骨钙丢失、促骨生成制剂中的应用。该专利技术通过在模拟失重条件下诱导C2C12成肌细胞为成骨细胞，并将miR-494的抑制剂转染至C2C12细胞后诱导为成骨细胞，发现ALP、OPG、Runx2的表达和活性上调，表明miR-494的抑制剂可促进成骨分化。但是，该专利技术仅使用了成肌细胞进行成骨诱导，并未使用骨源系的细胞如MC3T3-E1前成骨细胞作为研究对象，且同样缺乏动物实验的数据支持。综上所述，基于现有的技术和方法，一方面缺乏可促进成骨细胞功能和骨形成的微小RNA寡核苷酸，另一方面，在实际应用的过程中，更多的骨质疏松症发生在老年阶段，目前缺乏可抑制老年性骨质疏松的微小RNA寡核苷酸。
技术实现思路
为了弥补基于微小RNA的寡核苷酸在制备促进成骨细胞功能、抑制老年性骨质疏松症化合物应用中的空缺，本专利技术提供一种与老年性骨质疏松相关微小RNA的寡核苷酸化合物的应用。筛选获得与老年性骨质疏松相关的微小RNA，通过合成基于与老年性骨质疏松相关微小RNA的寡核苷酸并转染至前成骨细胞和老年骨质疏松小鼠体内，结果显示可促进成骨细胞功能，并抑制老年性骨质疏松症的进展。由于制备的基于与老年性骨质疏松相关微小RNA的寡核苷酸，可通过促进成骨细胞功能，抑制老年性骨质疏松症的程度，弥补了基于微小RNA的寡核苷酸在制备促进成骨细胞功能、抑制老年性骨质疏松化合物应用中的空缺。本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是：一种与老年性骨质疏松相关微小RNA的寡核苷酸化合物的应用，其特点是包括以下步骤：步骤一、收集老年性骨折患者术中移除的骨组织，提取组织总RNA，微小RNA表达普微阵列实验及生物信息学方法获得与非老年组差异表达的微小RNA；步骤二、qPCR法验证差异表达微小RNA在不同年龄患者骨组织中的实际表达水平，获得在老年性骨质疏松骨组织中下调表达的微小RNA为hsa-miR-182-5p、hsa-miR-574-5p、hsa-miR-125b-2-3p、hsa-miR-152-3p、hsa-miR-204-3p和hsa-miR-181c-5p；步骤三、依据从miRBase获得的下调表达的微小RNA成熟体核苷酸序列，使用固相亚磷酰胺三酯法合成寡核苷酸单链，5’-3’序列依次分别为uuuggcaaugguagaacucacacu、ugagugugugugugugagugugu、ucacaagucaggcucuugggac、ucagugcaugacagaacuugg、gcugggaaggcaaagggacgu和aacauucaaccugucggugagu；然后合成互补的双链；步骤四、高效液相色谱法纯化获得的产物；步骤五、产物进行全链甲基化、前后2’-4’位点硫代磷酸化骨架修饰以及3’末端胆固醇标记；步骤六、以上合成的微小RNA双链寡核苷酸，转染至体外培养的MC3T3-E1前成骨细胞，转染48小时后收取细胞样品进行成骨细胞标志基因及细胞矿化能力检测；步骤七、qPCR法验证步骤一中差异表达微小RNA在不同年龄患者骨组织中的实际表达水平，获得在老年性骨质疏松骨组织中上调表达的微小RNA为hsa-miR-1290、hsa-miR-486-3p、hsa-miR-20b-5p、hsa-miR-210-3p、hsa-miR-486-5p、hsa-miR-4299、hsa-miR-320a、hsa-miR-497-5p、hsa-miR-100-5p和hsa-miR-138-5p；步骤八、依据从miRBase获得的上调表达的微小RNA成熟体核苷酸序列，使用固相亚磷酰胺三酯法合成寡核苷酸单链，5’-3’序列依次分别为ucccugauccaaaaaucca、auccuguacugagcugccccg、cuaccugcacuaugagcacuuug、ucagccgcugucacacgcacag、cucggggcagcucaguacagga、gccucucaugucaccagc、ucgcccucucaacccagcuuuu、acaaaccacagugugcugcug、cacaaguucggaucuacggguu和cggccugauucacaacaccagcu；步骤九、高效液相色谱法纯化获得的产物；步骤十、产物进行全链2’甲基化、5’两个硫代磷酸位点修饰、3’四个硫代磷酸位点修饰以及3’末端胆固醇标记；步骤十一、以上合成的微小RNA单链寡核苷酸，经三次尾静脉注射至老龄小鼠体内，注射完成两周以后处死小鼠，收取骨组织进行骨密度、骨微结构检测。本专利技术的有益效果是：本专利技术筛选获得与老年性骨质疏松相关的微小RNA，通过合成基于与老年性骨质疏松相关微小RNA的寡核苷酸并转染至前成骨细胞和老年骨质疏松小鼠体内，结果显示可促进成骨细胞功能，并抑制老年性骨质疏松症的进展。由于制备的基于与老年性骨质疏松相关微小RNA的寡核苷酸，可通过促进成骨细胞功能，抑制老年性骨质疏松症的程度，弥补了基于微小RNA的寡核苷酸在制备促进成骨细胞功能、抑制老年性骨质疏松化合物应用中的空缺。以下结合附图和实施例详细说明本专利技术。附图说明图1是本专利技术实施例1获得的与老年性骨质疏松相关微小RNA在不同年龄患者骨组织中的表达水平。图2是实施例1制备的miR-20b-5p引物检测miR-20b-5p在老年卧床骨质疏松患者骨组织中的表达水平。图3是实施例2制备的miR-138-5p激动剂在转染MC3T3-E1前成骨细胞后qPCR法检测细胞碱性磷酸酶(左)和Runx2基因(右)的相对表达水平。图4是实施例2制备的miR-本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种与老年性骨质疏松相关微小RNA的寡核苷酸化合物的应用，其特征在于包括以下步骤：步骤一、收集老年性骨折患者术中移除的骨组织，提取组织总RNA，微小RNA表达普微阵列实验及生物信息学方法获得与非老年组差异表达的微小RNA；步骤二、qPCR法验证差异表达微小RNA在不同年龄患者骨组织中的实际表达水平，获得在老年性骨质疏松骨组织中下调表达的微小RNA为hsa‑miR‑182‑5p、hsa‑miR‑574‑5p、hsa‑miR‑125b‑2‑3p、hsa‑miR‑152‑3p、hsa‑miR‑204‑3p和hsa‑miR‑181c‑5p；步骤三、依据从miRBase获得的下调表达的微小RNA成熟体核苷酸序列，使用固相亚磷酰胺三酯法合成寡核苷酸单链，5’‑3’序列依次分别为uuuggcaaugguagaacucacacu、ugagugugugugugugagugugu、ucacaagucaggcucuugggac、ucagugcaugacagaacuugg、gcugggaaggcaaagggacgu和aacauucaaccugucggugagu；然后合成互补的双链；步骤四、高效液相色谱法纯化获得的产物；步骤五、产物进行全链甲基化、前后2’‑4’位点硫代磷酸化骨架修饰以及3’末端胆固醇标记；步骤六、以上合成的微小RNA双链寡核苷酸，转染至体外培养的MC3T3‑E1前成骨细胞，转染48小时后收取细胞样品进行成骨细胞标志基因及细胞矿化能力检测；步骤七、qPCR法验证步骤一中差异表达微小RNA在不同年龄患者骨组织中的实际表达水平，获得在老年性骨质疏松骨组织中上调表达的微小RNA为hsa‑miR‑1290、hsa‑miR‑486‑3p、hsa‑miR‑20b‑5p、hsa‑miR‑210‑3p、hsa‑miR‑486‑5p、hsa‑miR‑4299、hsa‑miR‑320a、hsa‑miR‑497‑5p、hsa‑miR‑100‑5p和hsa‑miR‑138‑5p；步骤八、依据从miRBase获得的上调表达的微小RNA成熟体核苷酸序列，使用固相亚磷酰胺三酯法合成寡核苷酸单链，5’‑3’序列依次分别为ucccugauccaaaaaucca、auccuguacugagcugccccg、cuaccugcacuaugagcacuuug、ucagccgcugucacacgcacag、cucggggcagcucaguacagga、gccucucaugucaccagc、ucgcccucucaacccagcuuuu、acaaaccacagugugcugcug、cacaaguucggaucuacggguu和cggccugauucacaacaccagcu；步骤九、高效液相色谱法纯化获得的产物；步骤十、产物进行全链2’甲基化、5’两个硫代磷酸位点修饰、3’四个硫代磷酸位点修饰以及3’末端胆固醇标记；步骤十一、以上合成的微小RNA单链寡核苷酸，经三次尾静脉注射至老龄小鼠体内，注射完成两周以后处死小鼠，收取骨组织进行骨密度、骨微结构检测。...
【技术特征摘要】
1.一种与老年性骨质疏松相关微小RNA的寡核苷酸化合物的应用，其特征在于包括以下步骤：步骤一、收集老年性骨折患者术中移除的骨组织，提取组织总RNA，微小RNA表达普微阵列实验及生物信息学方法获得与非老年组差异表达的微小RNA；步骤二、qPCR法验证差异表达微小RNA在不同年龄患者骨组织中的实际表达水平，获得在老年性骨质疏松骨组织中下调表达的微小RNA为hsa-miR-182-5p、hsa-miR-574-5p、hsa-miR-125b-2-3p、hsa-miR-152-3p、hsa-miR-204-3p和hsa-miR-181c-5p；步骤三、依据从miRBase获得的下调表达的微小RNA成熟体核苷酸序列，使用固相亚磷酰胺三酯法合成寡核苷酸单链，5’-3’序列依次分别为uuuggcaaugguagaacucacacu、ugagugugugugugugagugugu、ucacaagucaggcucuugggac、ucagugcaugacagaacuugg、gcugggaaggcaaagggacgu和aacauucaaccugucggugagu；然后合成互补的双链；步骤四、高效液相色谱法纯化获得的产物；步骤五、产物进行全链甲基化、前后2’-4’位点硫代磷酸化骨架修饰以及3’末端胆固醇标记；步骤六、以上合成的微小RNA双链寡核苷酸，转染至体外培养的MC3T3-E1前成骨细胞，转染48小时后收取细胞样品进行成骨细胞标志基因及细胞矿化能力检测；步骤七、qPCR...
【专利技术属性】
技术研发人员：骞爱荣，马剑华，赵帆，陈志浩，胡丽芳，李迪杰，印崇，马小莉，苏佩红，
申请(专利权)人：西北工业大学，
类型：发明
国别省市：陕西;61
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