一种快速生产高光学纯度D‑赖氨酸的方法技术

本发明专利技术公开一种快速生产高光学纯度D‑赖氨酸的方法，将L‑赖氨酸溶解，加入赖氨酸消旋酶全细胞，反应结束后去除赖氨酸消旋酶全细胞，得到D‑赖氨酸和L‑赖氨酸的混合水溶液，再加入赖氨酸脱羧酶粗酶液拆分DL‑赖氨酸，得到D‑赖氨酸和1,5‑戊二胺。本发明专利技术原料易得，生产成本低工艺简单，反应条件温和，D‑赖氨酸的光学纯度高达99%以上；而且L‑赖氨酸也转化为更有价值的1,5‑戊二胺，原料得到充分利用。

A rapid production of high optical purity of D lysine

The invention discloses a rapid production of high optical purity D lysine, L lysine dissolved, adding lysine racemase in whole cell, after the reaction, the removal of lysine racemase whole cell, D lysine and L lysine mixed aqueous solution of amino acids. Adding lysine decarboxylase enzyme separation DL lysine, D lysine and 1,5 amyl amine two. The invention is easy to get raw materials, low production cost, simple process, mild reaction conditions, D Lai optical purity acid ammonia up to more than 99%; and L lysine is converted to 1,5 amylamine two more valuable raw materials are fully utilized.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物催化
，特别涉及赖氨酸消旋酶快速消旋L-赖氨酸生成DL-赖氨酸和赖氨酸脱羧酶粗酶液高效拆分DL-赖氨酸生成高光学纯度的D-赖氨酸。
技术介绍
D-赖氨酸为非蛋白质氨基酸，它具有有效的抗真菌性和抗菌性，是新药开发的重要药物中间体，在医药上具有重要的作用。D-Lys是合成促黄体生成素释放激素类似物的前体，也可以用于合成促性腺激素释放激素高活性类似物，口服和静脉给药均可降低肿瘤治疗中放射性肽的肾摄取。D-Lys比L-Lys更适合在癌症治疗中使用。D-赖氨酸的多聚体，能刺激人软骨细胞和脑星形胶质细胞的增值，也是一种良好的药物载体。目前，国内外制备D-赖氨酸的方法主要是化学法，化学法是通过赖氨酸与手性酸生成非对映体盐，利用非对映体盐的溶解度差异而分离。通过化学方法来消旋制备D-Lys的操作流程较为复杂，且成本较高，通常需要强酸、强碱或者高温的环境，然而，化学拆分DL-Lys的效率并不高，且产品的光学纯度较低。生物酶法转化因具有反应条件温和及催化效率高的优点，已成为拆分或合成手性化合物的重要途径。 1,5-戊二胺（简称戊二胺），即尸胺，是生物体内广泛存在的具有生物活性的含氮碱，为蛋白质腐败时赖氨酸在脱羧酶作用下发生脱羧反应时生成的产物。在农业上， 1,5-戊二胺可用于调控植物衰老过程、促进雌雄蕊的发育，改善植物果实发育，提高果实产量；医学上，亦可以作为一种有效治疗痢疾的药物成份；工业上是一种极为重要的化工原料，与己二酸、琥珀酸和癸二酸等二元酸聚合可分别形成新型材料聚酰胺5.6、聚酰胺5.4和聚酰胺5.10。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种绿色环保拆分DL-Lys的方法并且能够联产D-赖氨酸和1,5-戊二胺，与化学生产法相比，其反应简单，成本低廉，更适用于工业化生产。一种快速生产高光学纯度D-赖氨酸的方法，其生产方法包括以下步骤：步骤一，构建表达赖氨酸消旋酶的基因工程菌；步骤二，培养表达赖氨酸消旋酶的基因工程菌；步骤三，以L-赖氨酸为原料，利用步骤二培养的菌种转化反应生产D-赖氨酸；步骤四，离心去除赖氨酸消旋酶菌体细胞，上清液煮沸灭活残留的赖氨酸消旋酶；步骤五，向步骤四得到的上清液中补加赖氨酸脱羧酶粗酶液和PLP（磷酸吡哆醛）后震荡反应，高效液相色谱法检测D-赖氨酸的生成量。具体地，步骤一所述构建表达赖氨酸消旋酶的基因工程菌的方法如下：根据已报导的Proteus mirabilis BCRC10725来源赖氨酸消旋酶lyr的氨基酸序列（NCBI登录号：WP_004243720.1）进行密码子优化后，全基因合成该序列，两端设计酶切位点NcoI和XhoI，亚克隆到载体pET28a上，获得重组质粒pET28a-lyr。将构建好的重组质粒pET28a-lyr用氯化钙法转化进入大肠杆菌表达宿主BL21（DE3）（购买自全示金公司），得到赖氨酸消旋酶表达菌种BL21（DE3）/pET28a-lyr。具体地，步骤二赖氨酸消旋酶基因工程菌培养方法具体为：挑取表达赖氨酸消旋酶的基因工程菌单菌落，接种于LB培养基，置于37℃过夜培养；再将该菌转接于LB培养基，接种量为LB培养基体积的1-5%，37℃培养2-3小时，加入IPTG至终浓度1mmol/L，30℃过夜培养，离心收集表达赖氨酸消旋酶的基因工程菌。具体地，步骤三中，转化反应具体方法为：向初始pH为6.0的0.2 mol/L 磷酸钾缓冲溶液中加入OD600=5的赖氨酸消旋酶全细胞和L-赖氨酸盐酸盐，反应温度为37 ℃、200 r /min振荡反应并定时取样。具体地，步骤四中，在12000rpm条件下，离心5min去除赖氨酸消旋酶菌体细胞。具体地，步骤五中，PLP的添加量为0.1-4mM，调节PH至7.0，反应温度为50℃，反应时间为2-4h。具体地，步骤五中，高效液相色谱法检测D-赖氨酸的方法为Agilent 1200 高效液相色谱；色谱柱为Chirex Chiral Columns；流动相：1mM CuSO4·5H2O溶于水和异丙醇的混合液，水与异丙酮的体积比为95:5；流速0.8ml/min；温度25℃；波长254nm。赖氨酸脱羧酶粗酶液来源于专利申请号为201610365537.7所构建的菌株。挑取表达赖氨酸脱羧酶的基因工程菌单菌落，接种于LB培养基，置于37℃过夜培养；赖氨酸脱羧酶基因工程菌转接于优化后的培养基中，接种量为1%，加入终浓度为0.6g/L的乳糖，37℃培养12小时；揺瓶发酵结束后，离心收集表达赖氨酸脱羧酶的基因工程菌，备用。将收集到的菌体用相应体积的缓冲液重悬起来，使用超声细胞破碎仪（破碎10min，超2s，停2s，4℃，功率300W），破碎完成后，12000rpm，4℃，离心10min获得赖氨酸脱羧酶粗酶液。有益效果是：1、本专利技术针对D-赖氨酸和1,5戊二胺的市场需求，克服了D-赖氨酸在生产中利用化学消旋的弊端，采用纯生物法消旋，在生物法拆分DL-赖氨酸过程中，将L-赖氨酸转化为附加价值更高，更易纯化的1,5戊二胺，从而实现纯生物法联产D-赖氨酸和1,5戊二胺的目的。2、本专利技术采用赖氨酸脱羧酶粗酶液进行后续拆分反应，相较于全细胞而言，粗酶液能够快速的将L-赖氨酸全部转化为1,5-戊二胺，使得D-赖氨酸的光学纯度能够达到99%以上。原因是1,5-戊二胺对细胞有毒害作用，导致采用全细胞催化时，不能够将L-赖氨酸全部转化为1,5-戊二胺，使得D-赖氨酸的光学纯度不高。3、本专利技术反应结束后，生成的二氧化碳易于除去，对产品的分离纯化没有干扰，反应体系中只剩下D-赖氨酸和1,5戊二胺，二者易于分离，有助于提高产品纯度、光学纯度和收率，降低分离成本。本方法的催化活性高，分离纯化简单，原料便宜，总的生产成本低，且转化速度快、转化率高，适用于大规模工业化生产。附图说明图1为本专利技术的联产D-赖氨酸和1,5-戊二胺的方法的反应原理示意图。具体实施方式 为更好的理解本专利技术的内容，下面结合具体实施例做进一步说明。实施例1：生产高光学纯度D-赖氨酸 本实施例生产高光学纯度D-赖氨酸的方法原理如图1所示。具体方法为： 步骤一，构建表达赖氨酸消旋酶的基因工程菌：根据已报导的Proteus mirabilis BCRC10725来源赖氨酸消旋酶lyr的氨基酸序列（NCBI登录号：WP_004243720.1）进行密码子优化后，全基因合成该序列，两端设计酶切位点NcoI和XhoI，亚克隆到载体pET28a上，获得重组质粒pET28a-lyr。将构建好的重组质粒pET28a-lyr用氯化钙法转化进入大肠杆菌表达宿主BL21（DE3），得到赖氨酸消旋酶表达菌种BL21（DE3）/pET28a-lyr。步骤二，培养表达赖氨酸消旋酶的基因工程菌：挑取表达赖氨酸消旋酶的基因工程菌单菌落，接种于LB培养基，置于37℃过夜培养；再将该菌转接于LB培养基，接种量为LB培养基体积的1-5%，37℃培养2-3小时，加入IPTG至终浓度1mmol/L，30℃过夜培养，离心收集表达赖氨酸消旋酶的基因工程菌。 步骤三，以L-赖氨酸为原料，利用步骤二培养的菌种转化反应生产D-赖氨酸：向初始pH为6.0的0.2 mol/L 磷酸钾缓冲溶液中加入OD600本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种快速生产高光学纯度D‑赖氨酸的方法，其特征在于：其生产方法包括以下步骤：步骤一，构建表达赖氨酸消旋酶的基因工程菌；步骤二，培养表达赖氨酸消旋酶的基因工程菌；步骤三，以L‑赖氨酸为原料，利用步骤二培养的菌种转化反应生产D‑赖氨酸；步骤四，离心去除赖氨酸消旋酶菌体细胞，上清液煮沸；步骤五，向步骤四得到的上清液中补加赖氨酸脱羧酶粗酶液和磷酸吡哆醛（PLP）后震荡反应，高效液相色谱法检测D‑赖氨酸的生成量。

【技术特征摘要】
1.一种快速生产高光学纯度D-赖氨酸的方法，其特征在于：其生产方法包括以下步骤：步骤一，构建表达赖氨酸消旋酶的基因工程菌；步骤二，培养表达赖氨酸消旋酶的基因工程菌；步骤三，以L-赖氨酸为原料，利用步骤二培养的菌种转化反应生产D-赖氨酸；步骤四，离心去除赖氨酸消旋酶菌体细胞，上清液煮沸；步骤五，向步骤四得到的上清液中补加赖氨酸脱羧酶粗酶液和磷酸吡哆醛（PLP）后震荡反应，高效液相色谱法检测D-赖氨酸的生成量。2.根据权利要求1所述的一种快速生产高光学纯度D-赖氨酸的方法，其特征在于：步骤一所述构建表达赖氨酸消旋酶的基因工程菌的方法如下：根据已报导的Proteus mirabilis BCRC10725来源赖氨酸消旋酶lyr的氨基酸序列（NCBI登录号：WP_004243720.1）进行密码子优化后，全基因合成该序列，两端设计酶切位点NcoI和XhoI，亚克隆到载体pET28a上，获得重组质粒pET28a-lyr，将构建好的重组质粒pET28a-lyr用氯化钙法转化进入大肠杆菌表达宿主BL21（DE3），得到赖氨酸消旋酶表达菌种Ecoli.BL21（DE3）/pET28a-lyr。3.根据权利要求1所述的一种快速生产高光学纯度D-赖氨酸的方法，其特征在于：步骤二赖氨酸消旋酶基因工程菌培养方法为：挑取表达赖氨酸消旋酶的基因工程菌单菌落，接种于LB培养...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈可泉，杨丽，王昕，
申请(专利权)人：南京工业大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32