本发明专利技术公开了一种新型转基因复合物及其制备方法与应用，转基因复合物由质量比为0.01～20：0.1～40：1的两亲性阳离子多肽、非病毒载体、核酸复合而成；两亲性阳离子多肽是具有SEQ ID No:1或SEQ ID No:2所示氨基酸序列的一种肽或任意配比的两种肽；非病毒载体是基于质子海绵效应的一种或任意配比的多种阳离子聚合物；核酸为质粒DNA、基因片段、双链或单链DNA片段、cDNA、siRNA、shRNA、mRNA、反义寡核苷酸中的一种或任意配比的多种的组合。本发明专利技术能够显著提高具有单一溶酶体逃逸效应的非病毒载体的转染效率，进而提高核酸的递送效率；此外，本发明专利技术采用分子自组装方法，可以方便的大规模制备转染复合物，而且该复合物在生物体内可降解，具有较高的使用安全性。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种复合物及其制备方法与应用，尤其涉及一种新型转基因复合物及其制备方法与应用。
技术介绍
安全高效的核酸递送技术可以广泛应用于重大疾病的基因治疗领域和生命科学的基础研究中。由于核酸自身的特性使其无法直接穿越细胞膜进入到细胞内，因此核酸的递送主要依赖核酸递送载体。一个安全有效的核酸递送载体必须克服一系列的生物结构障碍，如高效地细胞内吞、核酸载体进入细胞后有效的溶酶体逃逸、核酸在细胞质内的高效释放等。核酸递送载体分为病毒载体和非病毒载体两大类。其中病毒载体虽然具有较高的基因递送效率，但是病毒载体自身存在诸多问题，比如潜在的安全性问题如致病性以及免疫源性，无法递送大的核酸片段以及高昂的生产成本，这些问题限制了病毒载体在临床、科研方面的应用。作为病毒载体的代替手段，非病毒载体有较高的安全性，而且生产成本较低，但非病毒载体主要是通过网格蛋白内吞途径进行核酸递送，其溶酶体逃逸能力较低，造成其转染效率一直较低，成为影响非病毒载体广泛应用的主要问题。虽然非病毒载体可以通过诸多策略进行溶酶体逃逸，如阳离子聚合物的质子海绵效应、阳离子脂质体载体的膜融合效应、多肽类载体的膜穿孔效应，这些策略能够提供一定的溶酶体逃逸，但是拥有单一溶酶体逃逸策略的非病毒载体对于一些细胞系转染尤其是难转染细胞系的转染效率依然较低。目前针对非病毒载体转染效率较低的问题，人们研究较多是采用共价修饰的方法，在非病毒载体表面修饰功能基团，从而提高单一的溶酶体逃逸能力，可以在一定程度上提高转染效率，如在聚酰胺-胺型树枝状高分子(PAMAM)或聚乙酰亚胺(PEI)表面修饰精氨酸，进行氟基化等。但众所周知，共价修饰纯化过程繁琐耗时，不利于大规模生产，而且，目前方法大多旨在单方面的提高转染复合物单一的溶酶体逃逸效应，并没有尝试将两种溶酶体逃逸效应在一种非病毒载体为基础的转染复合物中联合使用。
技术实现思路
为了解决上述技术所存在的不足之处，本专利技术提供了一种新型转基因复合物及其制备方法与应用。为了解决以上技术问题，本专利技术采用的技术方案是：一种新型转基因复合物，由两亲性阳离子多肽、非病毒载体、核酸复合而成；两亲性阳离子多肽、非病毒载体、核酸的质量比为0.01～20：0.1～40：1；两亲性阳离子多肽是具有SEQ ID No:1或SEQ ID No:2所示氨基酸序列的一种肽或任意配比的两种肽；非病毒载体是基于质子海绵效应的一种或任意配比的多种阳离子聚合物；核酸为质粒DNA、基因片段、双链或单链DNA片段、cDNA、siRNA、shRNA、mRNA、反义寡核苷酸中的一种或任意配比的多种的组合；质粒DNA包括pEGFP质粒、睡美人转座子系统。阳离子聚合物包括聚酰胺-胺树形高分子、聚乙烯亚胺；聚酰胺-胺树形高分子的代数为1代到10代；所述聚乙烯亚胺为分枝状或链状。阳离子聚合物的氨基末端未经过其它基团修饰或经过修饰基团修饰，修饰基团包括组氨酸基团、鸟氨酸基团、聚乙二醇基团、转铁蛋白基团、氟基。一种新型转基因复合物的制备方法，首先对上述阳离子聚合物进行预活化处理或不做处理；然后将上述两亲性阳离子多肽、预活化处理后的阳离子聚合物、核酸按照质量比0.01～20：0.1～40：1以任意先后顺序或者同时进行复合，形成新型转基因复合物。预活化处理为对阳离子聚合物分子或其水溶液在30～70℃下孵浴1～24h，让部分结构的分支断裂使分子结构更具柔性。一种新型转基因复合物的应用，新型转基因复合物应用于提高包括难转染细胞系在内的真核细胞系的转染效率、提高应用睡美人转座子稳定转染真核细胞的效率、提高在高浓度血清中的转染效率，从而制备基因治疗药物以及转基因试剂。本专利技术中转基因复合物具备两种溶酶体逃逸效应，能够显著提高具有单一溶酶体逃逸效应的非病毒载体的转染效率，进而提高核酸的递送效率。本专利技术采用分子自组装方法，可以方便的大规模制备转染复合物，而且该复合物在生物体内可降解，具有较高的使用安全性。附图说明图1为PAMAM/DNA/LAH4-L1复合物的体外转染实验柱状图。图2为PAMAM/DNA/LAH4-L1复合物的粒度测定结果柱状图。图3为PAMAM/DNA/LAH4-L1复合物的体外细胞毒性测试柱状图。图4为PAMAM/DNA/LAH4-L1复合物在不同浓度血清中的转染实验柱状图。图5为PAMAM/DNA/LAH4-L1复合物对MDCK细胞的转染实验柱状图。图6为PEI/DNA/LAH4-L1复合物的体外转染实验柱状图。图7为PAMAM/DNA/LAH4-A4复合物的体外转染实验柱状图。图8为PAMAM/siRNA/LAH4-L1复合物的体外转染实验柱状图。图9为PAMAM/转座子/LAH4-L1复合物的体外转染实验结果图。具体实施方式下面结合附图和具体实施方式对本专利技术作进一步详细的说明。一种新型转基因复合物，由两亲性阳离子多肽、非病毒载体、核酸复合而成；两亲性阳离子多肽、非病毒载体、核酸的质量比为0.01～20：0.1～40：1；两亲性阳离子多肽是具有SEQ ID No:1或SEQ ID No:2所示氨基酸序列的一种肽或任意配比的两种肽；两亲性阳离子多肽包括LAH4-L1和LAH4-A4；LAH4-L1和LAH4-A4的氨基酸序列分别如下：LAH4-L1:KKALLAHALHLLALLALHLAHALKKA(SEQ ID NO:1)；LAH4-A4:KKALLHAALAHLLALAHHLLALLKKA(SEQ ID NO:2)；非病毒载体是基于质子海绵效应的一种或任意配比的多种阳离子聚合物；阳离子聚合物包括聚酰胺-胺树形高分子(PAMAM)、聚乙烯亚胺(PEI)；PAMAM的代数为1代到10代，并优选5代PAMAM分子，5代PAMAM分子的数均分子量为28826。PEI为分枝状或链状，并优选分枝状PEI分子，PEI的数均分子量优选为25kDa。阳离子聚合物的氨基末端未经过其它基团修饰或经过修饰基团修饰，修饰基团包括组氨酸基团、鸟氨酸基团、聚乙二醇基团、转铁蛋白基团、氟基。核酸为质粒DNA、基因片段、双链或单链DNA片段、cDNA、siRNA、shRNA、mRNA、反义寡核苷酸中的一种或任意配比的多种的组合；质粒DNA包括pEGFP质粒、睡美人转座子系统。一种新型转基因复合物的制备方法：首先对上述阳离子聚合物进行预活化处理或不做处理；预活化处理为对阳离子聚合物分子或其水溶液在30～70℃下孵浴1～24h，让部分结构的分支断裂使分子结构更具柔性，优选为将PAMAM或PEI水溶液在40℃条件下孵浴12小时。然后将上述两亲性阳离子多肽、预活化处理后的阳离子聚合物、核酸按照质量比0.01～20：0.1～40：1以任意先后顺序或者同时进行复合，形成新型转基因复合物。一种新型转基因复合物的应用：应用于提高包括难转染细胞系在内的真核细胞系的转染效率、提高应用睡美人转座子稳定转染真核细胞的效效率、提高在高浓度血清中的转染率，从而制备基因治疗药物以及转基因试剂。本专利技术用到的两亲性阳离子多肽可通过多肽合成仪进行化学合成，其它所有试剂均可通过普通商业途径进行购买。下面由以下具体实施例对本专利技术的制备方法及应用做进一步的阐述：实施例一：PAMAM/DNA/LA本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种新型转基因复合物，其特征在于：所述转基因复合物由两亲性阳离子多肽、非病毒载体、核酸复合而成；所述两亲性阳离子多肽、非病毒载体、核酸的质量比为0.01～20：0.1～40：1；所述两亲性阳离子多肽是具有SEQ ID No:1或SEQ ID No:2所示氨基酸序列的一种肽或任意配比的两种肽；所述非病毒载体是基于质子海绵效应的一种或任意配比的多种阳离子聚合物；所述核酸为质粒DNA、基因片段、双链或单链DNA片段、cDNA、siRNA、shRNA、mRNA、反义寡核苷酸中的一种或任意配比的多种的组合；所述质粒DNA包括pEGFP质粒、睡美人转座子系统。
【技术特征摘要】
1.一种新型转基因复合物，其特征在于：所述转基因复合物由两亲性阳离子多肽、非病毒载体、核酸复合而成；所述两亲性阳离子多肽、非病毒载体、核酸的质量比为0.01～20：0.1～40：1；所述两亲性阳离子多肽是具有SEQ ID No:1或SEQ ID No:2所示氨基酸序列的一种肽或任意配比的两种肽；所述非病毒载体是基于质子海绵效应的一种或任意配比的多种阳离子聚合物；所述核酸为质粒DNA、基因片段、双链或单链DNA片段、cDNA、siRNA、shRNA、mRNA、反义寡核苷酸中的一种或任意配比的多种的组合；所述质粒DNA包括pEGFP质粒、睡美人转座子系统。2.根据权利要求1所述的新型转基因复合物，其特征在于：所述阳离子聚合物包括聚酰胺-胺树形高分子、聚乙烯亚胺；所述聚酰胺-胺树形高分子的代数为1代到10代；所述聚乙烯亚胺为分枝状或链状。3.根据权利要求2所述的新型转基因复合物，其特征在于：所述阳...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘楠，
申请(专利权)人：刘楠，
类型：发明
国别省市：北京;11
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