用于治疗和/或预防腹泻的益生菌菌株制造技术

本发明专利技术涉及选择或鉴定能够作用于结肠中水分吸收的益生菌菌株的方法，及其作为用于治疗和/或预防腹泻的医药产品的用途。本发明专利技术尤其涉及用于治疗和/或预防腹泻的枯草芽孢杆菌菌株CU1。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于治疗和/或预防腹泻的益生菌菌株母案申请本专利申请案要求于2012年12月12日提交的法国专利申请第FR1261916号的优先权。该法国专利申请案的全部内容以引用方式并入本文。
本专利技术涉及用于治疗及/或预防腹泻的益生菌菌株，尤其是芽孢杆菌(Bacillus)的益生菌菌株的领域。本专利技术还涉及选择具有作用于结肠中水分吸收的特定性质的益生菌菌株的方法。
技术介绍
当正常运作时，人体结肠吸收约99％的进入其内腔的水分，这代表每天约2升水。结肠具有吸收额外的多达4水的能力。然而，每天超过6升水时，其吸收能力达到饱和而发生腹泻。腹泻是常见的问题(全球每年约20亿个病例)，其特征为较平常大量且频繁(每天排便多于3次)的水状或软性大便。在极端情况下，每天可损失超过20升的液体。腹泻不是疾病，而是一种症状。其最常见的原因是摄入受污染的水或食物；在这种情况下，其持续一或两天，而无需治疗。然而，腹泻本身可引起可能致命的脱水，尤其是在婴儿中，当体重减少超过10％时需送院急诊。根据世界卫生组织，腹泻是第三世界国家中婴儿致死原因中第二常见的，且5岁以下儿童的死亡病例中有18％是由其造成。(Bryce等,Lancet,2005,365:1147-1152)。由腹泻引起的脱水是在损失的液体未被补偿时发生。在正常情况下，水分是在结肠中从粪便里去除。包含在摄入物中的水分被再吸收的现象是在结肠细胞水平通过水分和电解质的主动和被动运输的组合发生。在结肠上皮的内陷隐窝的水平上，水分从血液分泌到外部环境中。在健康良好的人体中，这两种现象彼此互补，因而能保持大便适度含水，从而促进肠道转运并改善分子循环的条件。腹泻有许多可能的原因，包括由病毒、细菌或寄生性病原体引起的传染源性的腹泻及非传染性腹泻，例如由食物不耐性、脂肪饮食、酒精、心理因素、施用医药产品、施用治疗程序引起的腹泻、与疾病或临床病况相关的腹泻、或与停药相关的腹泻。根据症状的持续时间可区分急性腹泻和慢性腹泻，其症状分别持续不到两周及至少两周。用于治疗腹泻的典型药物为，例如洛哌丁胺(loperamide)，其通过刺激水分和电解质吸收，及减缓运输时间来起作用。然而，减缓运输时间在沙门氏菌(Salmonella)、志贺氏菌(Shigella)或艰难梭状芽孢杆菌(Clostridiumdifficile)型的严重传染中可能会产生问题，因为该病原菌长时间保留在肠道内。益生菌提供治疗和/或预防腹泻的引人关注的替换选择。最常用于此适应症的益生菌是乳酸菌。因此，益生菌通常被描述为对免疫系统和肠道菌群平衡具有有益作用。其他研究试图鉴定用于治疗或预防腹泻的新靶标。因此，文件WO2004/028480描述了通过CFTR蛋白(囊性纤维化跨膜转导调节因子)降低氯离子转运效率的噻唑烷酮型化合物及其于治疗分泌型腹泻的用途。Bradford等(Am.J.Physiol.Gastrointes.LiverPhysiol.，2009，296：G886-G898)检验了用于治疗罹患囊肿性纤维化(mucoviscidosis)的患者(其中CFTR的表达被改变)的肠阻塞及脱水的方法。此外，据描述，在患有囊肿性纤维化的小鼠中部分或完全丧失NHE3蛋白(钠氢交换体3)降低了肠阻塞的发病率，特别是通过增加肠道流动性，因而总结出NHE3是调节罹患囊肿性纤维化且其CFTR表达被改变的患者的肠道流动性的潜在靶标。因此，仍需要用于治疗和/或预防腹泻的新策略。专利技术简述总体上，本专利技术是基于某些益生菌菌株能够以完全新颖的方式通过诱导吸收结肠中存在的过量水分而直接作用于腹泻这一发现。令人惊讶且出乎意料的是，本专利技术人表明，某些益生菌菌株能够抑制涉及结肠中水分分泌的转运体(transporter)的表达和/或刺激涉及结肠中水分吸收的转运体的表达，因而可用于治疗和/或预防腹泻。因此，这些益生菌菌株以相当新颖的方式不作为转运体的抑制剂(即，不通过结合转运体来起作用)来阻碍其功能，而是作用于转运体的表达，从而作用于转运体的存在数量。再者，由于这些益生菌菌株是直接作用于结肠中存在的过量水分的吸收，其具有可以用于预防和/或治疗任何类型腹泻的优势，尤其是无论该腹泻是否为传染源性或非传染源性，以及有无菌丛失衡(dysbiosis)存在。因此，本专利技术涉及选择用于治疗和/或预防腹泻的益生菌菌株的方法，该方法包含以下步骤：-测量至少一种测试菌株对至少一种涉及结肠中水分吸收或分泌的转运体的表达的影响，和-选择至少一种引起至少一种涉及结肠中水分分泌的转运体表达减少和/或至少一种涉及结肠中水分吸收的转运体的表达增加的菌株。更具体地，在第一个方面，本专利技术涉及选择用于治疗和/或预防腹泻的益生菌菌株的方法，该方法包含以下步骤：-测量至少一种测试菌株对CFTR蛋白(囊性纤维化跨膜转导调节因子)的表达和/或NHE3蛋白(钠氢交换体3)的表达的影响，和-选择至少一种引起CFTR蛋白的表达减少及/或NHE3蛋白的表达增加的菌株。在某些实施方案中，该测试菌株为酵母菌株或细菌菌株。具体地，待测试的细菌菌株可为芽孢杆菌菌株，优选为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)菌株。在某些实施方案中，CFTR蛋白和/或NHE3蛋白的表达通过电泳、蛋白质印迹、免疫分析、免疫组织化学、免疫细胞化学、质谱、RT-PCR或RNA印迹测量。在另一个方面，本专利技术涉及使用根据本专利技术方法选择的用于治疗和/或预防腹泻的益生菌菌株。在某些实施方案中，益生菌菌株为枯草芽孢杆菌菌株，优选以保藏号1-2745于2001年10月25日保藏在CNCM(CollectionNationaledeCulturesdeMicroorganismes/国家微生物菌种保藏中心，25rueduDocteurRoux，75724ParisCedex15)的枯草芽孢杆菌菌株CU1。在一个次要的方面，本专利技术涉及通过培养根据本专利技术方法选择的益生菌菌株所得的用于治疗和/或预防腹泻的细胞。具体地，本专利技术涉及通过培养以保藏号1-2745于2001年10月25日保藏于CNCM的枯草芽孢杆菌菌株CU1所得的用于治疗和/或预防腹泻的枯草芽孢杆菌细胞。本专利技术还涉及在患者中治疗和/或预防腹泻的方法，其包含向所述患者施用有效量的通过培养根据本专利技术方法选择的益生菌菌株所得的细胞。在某些实施方案中，治疗和/或预防腹泻的方法包含施用通过培养枯草芽孢杆菌的益生菌菌株所得的枯草芽孢杆菌细胞，优选以保藏号1-2745于2001年10月25日保藏于CNCM的枯草芽孢杆菌菌株CU1。在另一个方面，本专利技术涉及用于治疗和/或预防腹泻的组合物，所述组成物包含至少一种根据本专利技术的益生菌菌株，或通过培养所述菌株所得的细胞。具体地，所述组合物包含通过培养以保藏号1-2745于2001年10月25日保藏于CNCM的枯草芽孢杆菌菌株CU1所得的枯草芽孢杆菌细胞。可根据本专利技术预防性和/或治疗性治疗的腹泻形式包括急性腹泻和慢性腹泻。在某些实施方案中，根据本专利技术治疗的腹泻是由病毒、细菌或寄生性病原体引起的传染源性的腹泻。在其他实施方案中，根据本专利技术治疗的腹泻是非传染源性的腹泻。非传染源性的腹泻是，例如由食品不耐受引起的腹泻、由脂肪饮食引起的腹泻、由酒精引起的腹泻本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种选择用于治疗和/或预防腹泻的益生菌菌株的方法，所述方法包含以下步骤：‑测量至少一种测试菌株对至少一种涉及结肠中水分分泌的转运体或至少一种涉及结肠中水分吸收的转运体的表达的影响，和‑选择至少一种引起至少一种涉及结肠中水分分泌的转运体的表达减少和/或至少一种涉及结肠中水分吸收的转运体的表达增加的菌株。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2012.12.12 FR 12619161.一种选择用于治疗和/或预防腹泻的益生菌菌株的方法，所述方法包含以下步骤：-测量至少一种测试菌株对CFTR蛋白的影响，和-选择至少一种引起CFTR蛋白的表达减少的菌株。2.如权利要求1所述的选择方法，所述方法进一步包含以下步骤：-测量至少一种测试菌株对NHE3蛋白的表达的影响，和-选择至少一种引起NHE3蛋白表达增加的菌株。3.如权利要求1或2所述的选择方法，其特征在于，所述测试菌株是酵母菌株或细菌菌株。4.如权利要求3所述的选择方法，其特征在于，所述细菌菌株是芽孢杆菌菌株。5.如权利要求4所述的选择方法，其特征在于，所述芽孢杆菌菌株是枯草芽孢杆菌菌株。6.如权利要求1或2所述的选择方法，其特征在于，所述CFTR蛋白和/或NHE3蛋白的表达通过电泳、免疫分析法、质谱法、RT-PCR或RNA印迹法测量。7.如权利要求6所述的选择方法，其特征在于，所述免疫分析法通过蛋白质印迹法、免疫组织化学法或免疫细胞化学法进行。8.如权利要求6所述的选择方法，其特征在于，所述测试菌株是酵母菌株或细菌菌株。9.如权利要求8所述的选择方法，其特征在于，所述细菌菌株是芽孢杆菌菌株。10.如权利要求9所述的选择方法，其特征在于，所述芽孢杆菌菌株...

【专利技术属性】
技术研发人员：M·库翁雨，J·菲奥拉蒙蒂，M·雨尔达西，
申请(专利权)人：乐斯福公司，国家农艺研究院，波尔多国立高等农业科学学校，
类型：发明
国别省市：法国;FR