本发明专利技术公开了一种葡萄炭疽病菌LAMP检测引物组及其检测方法，属于果树病害检测、鉴定及防治技术领域,设计了一种葡萄炭疽病菌LAMP检测引物组，序列如SEQ ID NO.1-4所示，经恒温扩增和加入荧光显色剂显色或琼脂糖凝胶电泳检测，可观察到亮绿色荧光或出现梯形条带。本发明专利技术的LAMP检测引物组及其检测方法可用于葡萄植株和果实中葡萄炭疽病菌的检测，同时可用于田间葡萄炭疽病的早期诊断和病原菌的监测与鉴定，为葡萄炭疽病菌引起的病害的防治提供可靠的技术和理论依据。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种葡萄炭疽病菌LAMP检测引物组及其检测方法，专用于葡萄炭疽病菌高灵敏度快速分子检测，同时可用于田间葡萄炭疽病的早期诊断和病原菌的监测与鉴定，属于果树病害检测、鉴定及防治
技术介绍
葡萄炭疽病(Elsinoe ampelina)是引起果实腐烂的重要真菌病害之一，其病原是胶抱炭疽菌(Colletotrichum gloeospor1ides)和尖抱炭疽菌(C.acutatum)。美国于1891年最先报道葡萄炭疽病害，之后在世界很多地区均发现该病害。葡萄感染病原菌后，不仅造成产量严重减少，而且品质也受到严重影响。早期研宄认为葡萄炭疽病是由胶孢炭疽菌感染引起的，随后在美国、日本和澳大利亚等的研宄发现尖孢炭疽菌也可侵染葡萄引起葡萄炭疽病。目前对葡萄炭疽病菌的检测大多仍沿用传统的分离培养及鉴定方法，然而，传统检测法耗时、耗力、效率低，且要求操作者具备专业的病原菌分离技术和丰富的形态学鉴定知识与经验。葡萄炭疽病菌从感染到发病有一个相当长的潜伏期，容易因低效的检测方法而错过早期诊断和防治的最佳时机。因此，探索一套快速、准确、灵敏、特异的葡萄炭疽病菌检测技术，做好葡萄炭疽病的早期诊断，对防止该病害传播具有极其重要的意义。PCR技术能够较快速、准确地检测出病原，但需要特定的仪器设备且检测成本较高，不适宜基层检验检疫部门田间大规模应用，致使田间病情无法得到及时、准确的检测和有效的控制。环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplificat1n,LAMP)技术是由Notomi等于2000年开发的一种高效的核酸恒温扩增方法。LAMP反应在等温条件下，短时间内实现产物的大量扩增，具有很高的特异性和灵敏度，且操作步骤简便，检测结果可由肉眼判断，因此更适合于基层检验检疫部门开展工作，具有极为广泛的应用前景。目前LAMP检测主要应用于人畜病原物、食品安全和环境卫生的检测，在植物病原菌检测中报道较少，葡萄炭疽病菌LAMP检测国内外均未见报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有传统检测技术中的不足之处，本专利技术的第一个目的是提供一种葡萄炭疽病菌LAMP检测引物组，本专利技术的第二个目的是提供葡萄炭疽病菌LAMP检测方法。本专利技术的检测方法经一次恒温扩增，就可以达到快速检测葡萄炭疽病菌的目的，检测结果可靠、灵敏度高、特异性强且易于操作，可用于田间葡萄炭疽病的早期诊断和病原菌的监测与鉴定，为葡萄炭疽病菌引起的病害的防治提供可靠的技术和理论依据。为了实现上述第一个目的，本专利技术采用以下技术方案: 葡萄炭疽病菌LAMP检测引物组设计从GenBank中下载葡萄炭疽病菌ITS序列(登录号:AB218993.1 )，根据葡萄炭疽病菌ITS序列，采用PrimerExplorer V4软件设计一种LAMP检测引物组，包括I对外引物(TJ-F3和TJ-B3)和I对内引物(TJ-FIP和TJ-BIP)，引物序列分别为:TJ-F3: 5' -ATGCCTGTTCGAGCGTCA-3'TJ-B3: 5' -TCCGAGGTCAACCTTTGGAA-3'TJ-FIP:5' -GCCACTACCTTTGAGGGCCTACTTTCAACCCTCAAGCTCTGC-3'TJ-BIP:5' -CGGAGCCTCCTTTGCGTAGTAAGGGTTTTACGGCAAGAGTCC-3' 为了实现上述第二个目的，本专利技术采用以下技术方案: 葡萄炭疽病菌LAMP检测方法，该方法包括以下步骤: Cl)按常规方法提取葡萄炭疽病菌基因组DNA ; (2)葡萄炭疽病菌LAMP检测反应体系，所述的LAMP反应体系25 μ?:包括引物组5μΜTJ-F3、5PM υ_Β3、40μΜ TJ-FIP 和 40μΜ TJ-BIP 各 ?μ?，12.5.Ομ? 反应混合液，?μ? 荧光显色剂，WL m) Bstmk聚合酶，50ng DNA模板，用灭菌双蒸水补足至25 μ?。混匀，进行恒温扩增，后灭活。(3)所述恒温扩增温度范围为61°C ~65°C，反应时间60 ~70min，82°C灭活1min ； (4)LAMP反应结果检测方法为荧光染料目测观察法和琼脂糖凝胶电泳法。所述荧光染料目测观察法:在LAMP反应前于反应液中加入WL荧光显色剂，所述荧光显色剂为1.25mM钙黄绿素和12.5mM氯化锰混合液，观察到亮绿色荧光判断为阳性，橙色判断为阴性；或取2^1扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测，如出现梯形条带判断为阳性，无扩增条带则判断为阴性。所述的反应混合液中含有12 mmol /T, MgS04、2mmol/L dNTPs、1.6mol/L Betaine、2% TWeen_20、5 μ L 10 X Thermopol Buffer0有益效果:本专利技术方法适用于发病植株或果实中葡萄炭疽病菌的高灵敏度快速分子检测和鉴定，对葡萄炭疽病菌引起的病害防治具有重要的实用价值。本专利技术与现有技术相比，具有以下技术优势: 1、结果可靠:本专利技术所设计出的LAMP检测引物组，已对中国福建、江西和北京等地的葡萄炭疽病菌进行了测试验证，因此充分保证检测结果的可靠性； 2、特异性强:本专利技术所采用的LAMP引物组是针对葡萄炭疽病菌ITS序列中6个不同区域设计出4条特异性引物，因此大大提高了检测特异性。3、灵敏度高:LAMP对葡萄炭疽病菌的检测灵敏度在DNA水平上可达到500fg。4、实用性好:本专利技术所设计出的LAMP引物组，可用于带葡萄炭疽病菌的植株和果实的高灵敏度快速检测和鉴定，具有很强的实用性； 5、操作简单:应用本专利技术方法，可在数小时内完成对带葡萄炭疽病菌的植株和果实的检测，检测结果准确可靠。LAMP检测在等温条件下进行，只需一个恒温水浴锅即可，不需要复杂的仪器设备、操作步骤和昂贵的分子试剂，检测结果肉眼可直接观察。【附图说明】图1为本专利技术葡萄炭疽病菌LAMP特异性检测结果图。其中:M为DL 2000 DNAmarker, I为阳性对照，2为阴性对照，3_7为葡萄炭疽病菌，8_11为其他真菌和卵菌。图2为本专利技术葡萄炭疽病菌LAMP灵敏度检测结果图。其中:M为DL 2000 DNAmarker, 1- 8 分别为 50ng, 5ng, 500 pg, 50 pg, 5pg, 500 fg, 50 fg 和 5fg。图3为本专利技术发病果实检测结果图。其中:M为DL 2000 DNA marker, I为阳性对照，2为阴性对照，3-5为发病果实，6-8为健康果实。【具体实施方式】本专利技术的
技术实现思路
包括葡萄炭疽病菌LAMP检测引物组，LAMP引物及其序列分别为:TJ-F3: 5' -ATGCCTGTTCGAGCGTCA-3'TJ-B3: 5' -TCCGAGGTCAACCTTTGGAA-3'TJ-FIP:5' -GCCACTACCTTTGAGGGCCTACTTTCAACCCTCAAGCTCTGC-3'TJ-BIP:5' -CGGAGCCTCCTTTGCGTAGTAAGGGTTTTACGGCAAGAGTCC-3' 利用LAMP引物组检测葡萄炭疽病菌显色结果可观察到亮绿色荧光或琼脂糖凝胶电泳出现梯形条带。[当前第1页1 2 本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种葡萄炭疽病菌LAMP检测引物组，其特征在于：所述LAMP检测引物组分别为：TJ‑F3：5′‑ATGCCTGTTCGAGCGTCA‑3′；TJ‑B3：5′‑TCCGAGGTCAACCTTTGGAA‑3′；TJ‑FIP：5′‑GCCACTACCTTTGAGGGCCTACTTTCAACCCTCAAGCTCTGC‑3′；TJ‑BIP：5′‑CGGAGCCTCCTTTGCGTAGTAAGGGTTTTACGGCAAGAGTCC‑3′。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王贤达，雷龑，陈婷，刘鑫铭，蔡盛华，范国成，
申请(专利权)人：福建省农业科学院果树研究所，
类型：发明
国别省市：福建;35
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