一种基于克隆和常规测序鉴定肉制品材料来源的方法技术

本发明专利技术涉及分子生物学技术领域，公开了一种基于克隆和常规测序鉴定肉制品材料来源的方法，包含下述步骤：(1)提取待测基因组DNA；(2)设计并合成正向引物和反向引物；(3)对基因组DNA进行PCR扩增，对扩增产物检测并回收；(4)对PCR扩增产物进行TA克隆，得到阳性克隆，挑取单克隆进行测序；(5)对测序结果去除两端的载体序列，得到待测肉制品的COI序列信息，由此鉴定待测肉制品的材料来源。利用该方法可对肉制品的材料组成和来源进行鉴定，由于COI基因序列中碱基序列的差异能很好地区分物种，因此该方法对肉制品材料来源进行鉴定具有较高的准确性。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及分子生物学
，特别涉及一种基于克隆和常规测序鉴定肉制品 材料来源的方法。
技术介绍
随着经济的发展和人民生活水平的提高，肉类和肉制品的消费发展极为迅猛，由 于不同品种肉类的价值差异巨大，错误标签和以次充好的现象越来越多。确定产品所用的 肉类，进行产品标签信息的验证，能够起到保护消费者权益、打击造假和错误标签、保障进 出口产品质量的作用。而确定产品所用肉类，必须要有可靠而准确的肉类物种鉴别方法。 肉类物种的鉴定，主要有形态学方法和分子生物学方法。传统的形态学鉴定方法 是在演化的背景下依据形态和结构、生理和生化特征、行为习性表现以及少量的化石资料 来构建生物物种之间的关系。传统的形态学鉴定方法只适用于完整形态的肉的样品，一旦 进行了加工，如鱼肉片、肉糜等，那些用于鉴定的特征就可能被破坏，形态学鉴定就会变得 困难，也会导致其最终鉴定结果的不准确。 但无论如何加工，动物的DNA始终存在和不可改变，因此采用DNA信息对肉制品原 料来源进行鉴定，是一个不错的选择。2003年，加拿大动物学家Paul Hebert等提出线粒体 细胞色素 C氧化酶亚基（COI)基因序列中碱基序列的差异能很好地区分所有的研宄物种。 该种基于DNA信息鉴定区分物种的方法，具有较高的准确性。
技术实现思路
本专利技术的一个目的在于提供一种借助分子生物学手段，对肉制品进行DNA信息采 集后，基于克隆和常规测序的方法，以待测肉制品的COI序列信息对肉制品原料来源进行 鉴定的方法。 为解决上述技术问题，本专利技术的实施方式所提供的基于克隆和常规测序鉴定肉制 品材料来源的方法，包含下述步骤： (1)提取待测肉制品的基因组DNA ; ⑵设计并合成SEQ ID NO: 1所示的正向引物和SEQ ID NO:2所示的反向引物； (3)采用步骤⑵中所述的正向引物和反向引物，对步骤⑴中所提取的基因组 DNA进行PCR扩增，然后对PCR扩增产物进行检测并回收； (4)对步骤（3)中回收得到的PCR扩增产物进行TA克隆，得到阳性克隆，然后挑取 阳性单克隆进行测序；对测序结果去除两端的载体序列，得到待测肉制品的COI序列信息， 由此鉴定待测肉制品的材料来源。 本专利技术的实施方式所提供的上述鉴定方法，在提取了待测肉制品基因组DNA之 后，通过对已发表动物的COI基因序列进行比对，在相对保守序列设计了适用物种广的通 用引物（SEQ ID NO: 1所示的正向引物和SEQ ID NO:2所示的反向引物），对所提取的待测 肉制品基因组DNA进行PCR扩增。本专利技术的实施方式中所设计的广谱通用引物，适用于包括 脊椎动物和无脊椎动物共11门，由于一些深加工的肉制品中材料来源多样化，因此本专利技术 所设计的广谱通用引物确保了后续扩增的效率及鉴定的准确性。此外，考虑到肉制品中原 料的复杂性，本专利技术的实施方式在对待测基因组DNA进行PCR扩增后，采用克隆后挑取单克 隆测序的方法进行测序，对得到的测序结果去除两端的载体序列，得到COI序列信息；对得 到的COI序列信息在数据库中进行比对，进而得到物种信息。利用本专利技术的实施方式所提 供的鉴定方法，可对各种肉制品的材料组成和来源进行鉴定，由于COI基因序列中碱基序 列的差异能很好地区分物种，因此该方法对肉制品材料来源进行鉴定具有较高的准确性。 优选地，本专利技术的实施方式所提供的基于克隆和常规测序鉴定肉制品材料来源的 方法，步骤（1)中提取待测样品DNA采用SDS法进行。 优选地，本专利技术的实施方式所提供的基于克隆和常规测序鉴定肉制品材料来源 的方法，步骤（3)中进行PCR扩增的反应体系组成为：基因组DNA 1.0ul，10XBuffer(含 2.5禮1%2+)5.〇111，511/^1^的丁&9聚合酶1.〇111，1〇1111的（1阶1 31.〇111，1〇11]\1的正向引物 1.5ul，10uM的反向引物1.5ul，CldH2O 39. Oul，总体积为50.0 ul。该PCR扩增的反应程 序为：预变性：95°C 5min，变性：95°C 30s，退火：55°C 45s，延伸：72°C lmin30s，终延伸： 72°C 7min ;其中，以变性、退火和延伸为一个循环，进行45个循环。本专利技术的实施方式在针 对待测肉制品的基因组DNA进行PCR扩增时，在扩增体系的组成和在扩增反应的反应程序 上，都进行了实验条件的优化，所采用的均为最适实验条件。 优选地，本专利技术的实施方式所提供的基于克隆和常规测序鉴定肉制品材料来源的 方法，步骤（3)中对PCR扩增产物进行检测的方法为1%琼脂糖凝胶电泳法，在进行1%琼 脂糖凝胶电泳法检测时，取3ulPCR扩增产物进行检测，确认PCR扩增片段。在对PCR扩增 产物进行确认之后，本专利技术的实施方式采用DNA凝胶回收试剂盒对PCR扩增产物进行回收。 例如可采用AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒回收，具体操作可按试剂盒说明书进行。 优选地，本专利技术的实施方式所提供的基于克隆和常规测序鉴定肉制品材料来源的 方法，步骤（4)中对PCR扩增产物进行测序和结果分析时，对PCR产物进行TA克隆时采用 的载体为PMD18-T载体，例如可以是TAKARA的PMD18-T载体。在得到阳性克隆之后，对阳 性单克隆进行测序的方法为Sanger测序法。而最终根据待测肉制品的COI序列信息鉴定 待测肉制品的材料来源的方法是：将待测肉制品的COI序列信息，与已知物种的COI基因序 列进行比对，从而得出待测肉制品的材料来源。【附图说明】 图1是实施例1中提取得到的待测肉制品基因组DNA的电泳检测图； 图2是实施例1中待测肉制品基因组DNA的PCR扩增产物的电泳检测图。【具体实施方式】 为使本专利技术的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本专利技术的各实 施方式进行详细的阐述。然而，本领域的普通技术人员可以理解，在本专利技术各实施方式中， 为了使读者更好地理解本申请而提出了许多技术细节。但是，即使没有这些技术细节和基 于以下各实施方式的种种变化和修改，也可以实现本申请各权利要求所要求保护的技术方 案。 实施例1罐头肉制品的材料来源鉴定 1、取肉制品罐头，对罐头内的肉制品进行DNA提取，提取时采用美国Axygen生物 科技有限公司的DNA提取试剂盒进行，提取操作步骤为： 1)取20mg肉制品，移入冰水浴预冷的研钵中，快速、用力研磨成匀浆。 2)加入 350 μ I Buffer PBS 和 0. 9 μ I RNase A 后温和地研磨 30s。 3)收集350 μ 1研磨好的组织匀浆并转入2ml离心管。如匀浆体积不足350 μ 1， 补充PBS至350 μ 1。 4)加入150 μ I Buffer C-L和20 μ 1蛋白酶Κ。立即漩涡振荡Imin混合均匀。短 暂离心后，将离心管置56°C水浴lOmin。（不要将蛋白酶K直接加到Buffer C-L中）。 5)加入 350 μ I Buffer P-D，漩涡振荡 30s 混合均匀，12, OOOXg 离心 lOmin。 6)将DNA制备管置于2ml离心管中，将步骤5中的混合液移至制备管中， 12, OOO Xg 离心 Imin0 7)弃滤液，将制备管置回到原来本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于克隆和常规测序鉴定肉制品材料来源的方法，其特征在于，包含下述步骤：(1)提取待测肉制品的基因组DNA；(2)设计并合成SEQ ID NO:1所示的正向引物和SEQ ID NO:2所示的反向引物；(3)采用步骤(2)中所述的正向引物和反向引物，对步骤(1)中所提取的基因组DNA进行PCR扩增，然后对PCR扩增产物进行检测并回收；(4)对步骤(3)中回收得到的PCR扩增产物进行TA克隆，得到阳性克隆，然后挑取阳性单克隆进行测序；(5)对步骤(4)中测序的结果，去除两端的载体序列，得到待测肉制品的COI序列信息，由此鉴定待测肉制品的材料来源。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：孙子奎，高文学，丁方美，王峰，方婉，
申请(专利权)人：上海派森诺生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31