血清ssc‑miR‑215作为检测仔猪肠道应激损伤分子标记物的应用制造技术

本发明专利技术属于生物学领域，涉及血清ssc‑miR‑215作为检测仔猪肠道应激损伤分子标记物的应用，血清ssc‑miR‑215的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示，反转录ssc‑miR‑215所需的茎－环引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，扩增ssc‑miR‑215所需的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，采用上述引物可实现断奶仔猪肠道应激损伤的诊断，诊断方法包括血清总RNA的提取、小分子RNA的分离、cDNA合成、PCR扩增和鉴定，本发明专利技术将为断奶仔猪肠道应激损伤的预防、诊断和治疗提供指导,为猪抗应激品系的标记辅助选择提供一个新的分子标记物。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于家畜基因工程
，具体涉及血清ssc-miR-215作为检测仔猪肠 道应激损伤分子标记物的应用。
技术介绍
仔猪断奶应激是全世界生猪养殖中的一大难题，每年都给养猪业造成巨大的经济 损失。应激导致的仔猪腹泻，更是目前养猪生产中最常见和危害性最大的一种应激性疾 病。断奶应激主要的靶点是仔猪的胃肠道，其中对小肠的损伤尤为严重。断奶应激引发的 仔猪小肠组织损伤和重建严重影响了仔猪肠道的发育和成熟，从而制约了仔猪的健康和生 长。同样，断奶应激引发肠道损伤致使胃肠酶合成和吸收能力的下降被认为是断奶仔猪腹 泻的原发性因素（伍晓雄，1999);肠黏膜受损是导致仔猪腹泻的主要原因之一（严宏祥等， 2006)。故断奶期被认为是肠道发育的一个重要时期，在这个时期由于仔猪的肠道尚未发育 成熟，断奶应激有可能对仔猪肠道健康造成终生影响（Smith et al，2010)。 目前，肠道受损最有力的直接证据是将仔猪屠宰后进行肠粘膜形态学变化的检 测。肠绒毛高度的降低和隐窝深度的增加是研宄报道中证实肠粘膜结构受损的一项最主要 的指标（Nabuurs等，1993)。然而，屠宰破坏性的研宄只能用于研宄机理的阐述。若能通 过非屠宰的方式，例如在血液中发现可靠的反映肠道应激损伤的指标，对于尽早预防、诊断 和治疗肠道应激损伤、提高养猪生产性能、增加养猪经济效益，以及特别是将其作为分子标 记物应用于猪分子育种中提高生猪整体健康水平，均具有非常重要的生产实践意义和科学 意义。因此，科学家们对断奶仔猪血清/血浆中二胺氧化酶（DAO)活性、D-乳酸含量和皮 质醇含量等的变化进行了相关研宄（钱仲仓等，2009 ;钟武装等，2013 ;胡彩虹等，2013 ;黄 其春等，2014 ;Wolvekamp等，1994 ;黎君友等，2000 ;胡泉舟，2007)。但上述指标变化的检 测均为相对值，要求有相应对照样品做参比并通过对数据进行显著性差异分析才能得出结 论，因此不具备诊断价值。 血清/血衆miRNAs的发现无疑是miRNAs研宄领域中的一项重大突破，为miRNAs 在动物上的研宄提供了新的研宄思路。现有研宄证实血清miRNAs不仅存在且具有广泛性、 稳定性和特异性，特别是具有无创性和便捷性等无可比拟的优点。此外，它的变化与机体的 生长发育、疾病发生发展和应激等多种生理现象密切相关。Mitchell等（2008)首先在肿瘤 患者血衆中证实了 miRNAs的存在。几乎同时，Chen等又在健康人类、肺癌、结肠癌和糖尿病 等疾病患者以及包括鼠、牛和马等动物血清和血浆中检测到了多种miRNAs，并证实miRNAs 在血清和血浆中无显著差异、且其含量几乎不受室温、高温、pH、多次冻融的影响。Gilad等 (2008)通过比较妊娠妇女血清、尿液、唾液、羊水和胸膜液中的miRNAs，认为血清miRNAs更 适合作为一种新型生物标记物。Blondal等（2013)指出当机体发生病理变化时，miRNAs可 快速从组织释放到体液。提示血清循环miRNAs具有及时、特异性反映机体生理状态的优 势。已有报道表明血清/血浆miRNAs的检测有助于诊断组织器官损伤（Redell等，2010)、 关节炎（Murata等，2010)、心血管系统疾病（Ti jsen等，2012)、肝炎（Zhang等，2012)和 糖尿病（Guay等，2013)等多种疾病，特别是在各种恶性肿瘤方面的研宄成果更为丰富（Liu 等，2013 ;Madhavan 等，2013 ;Sozzi 等，2014)。
技术实现思路
本专利技术的目的针对现有技术的不足，提供血清ssc-miR-215作为检测仔猪肠道应 激损伤分子标记物的应用。 本专利技术的目的是通过以下技术方案实现的： ，所述 ssc-miR-215的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。 进一步地，所述ssc-miR-215的反转录引物（莖-环引物）如SEQ ID NO. 2所示。 进一步地，所述ssc-miR-215正向引物如SEQ ID NO. 3所示，ssc-miR-215反向引 物如SEQ ID NO. 4所示。 上述应用包括以下步骤： (1)收集断奶仔猪全血，制备血清样品； (2)米用 Plasma/Serum Exosome Kit (Norgen，492〇0)试剂提取血清样品中 total RNA ； (3)米用 miRNeasy Mini Kit (Qiagen 217004)试剂盒提取 total RNA 中的血清中 小分子RNA ; (4)采用如SEQ ID NO. 2所示的ssc-miR-215反转录引物对小分子RNA进行反 转录，获得cDNA :所述反转录体系为：小分子RNA样品2. 5ul (40ng/ul)、ssc-miR-215反 转录引物 〇.5ul(2uM)、dNTP 0.25ul(10mM each)、5XRT buffer 1.0 ul、RNase inhibitor 0. 25ul (40U/ul)、M-MLV 0. 5ul (200U/ul)，反应体系总体积为5. Oul，将均匀混合的反应体 系放置42°C反应60min，再放置70°C反应15min，4°C保存； (5)以U6为内参，采用ssc-miR-215的正向引物和反向引物对cDNA进行荧光定 量 PCR;反应体系为：步骤 4 得到的 cDNA 1.0ul、2XSYBR Green Mix 10.0ul、RNase-free Water 8.2ul、SEQ ID NO. 3 所示的 ssc-miR-215 正向引物 0· 4ul (IOuM)，SEQ ID NO. 4 所示 的ssc-miR-215反向引物0. 4ul (IOuM)，反应体系总体积为20.0 ul ;荧光定量PCR反应条 件：50°C反应 2min、95°C反应 5min ;然后 95°C反应 15s、60°C反应 15s，40cycles。 (6)荧光定量PCR结果Λ Ct值若为负值，则表明断奶仔猪肠道应激损伤；若荧光 定量PCR结果△ Ct值为正值，则表明断奶仔猪肠道没有发生应激损伤。 本专利技术的有益效果在于：本专利技术填补了目前断奶仔猪肠道应激损伤诊断方法 的空白，提供了。本发 明的优点在于：本专利技术首次公开了采用血清ssc-miR-215以及分别用于反转录和扩增 ssc-miR-215的茎一环引物和正向引物、内参基因为U6对断奶仔猪的肠道应激进行诊断， 诊断结果ACt值结果若为负值，则表明断奶仔猪肠道应激损伤，ACt值为正值，则表明断 奶仔猪肠道没有发生应激损伤。该标记物的发掘和应用为断奶仔猪肠道应激损伤的预防、 诊断和治疗提供指导，特别是为猪抗应激品系的标记辅助选择提供一个新的分子标记物。【附图说明】 图1为3号仔猪空肠绒毛形态图； 图2为5仔猪空肠绒毛形态图； 图3为13号仔猪空肠绒毛形态图； 图4为15仔猪空肠绒毛形态图。【具体实施方式】 实施例1 :本实施例通过断奶仔猪的血清microRNA和肠道microRNA相关性分析， 获得ssc-miR-215,包括以下步骤： 1.仔猪肠道样品总RNA提取 从胎次及出生日期均相同的4窝、25日龄仔猪中选本文档来自技高网...

【技术保护点】
血清ssc‑miR‑215作为检测仔猪肠道应激损伤分子标记物的应用，其特征在于，所述ssc‑miR‑215的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：陶新，徐子伟，
申请(专利权)人：浙江省农业科学院，
类型：发明
国别省市：浙江;33