本发明专利技术涉及人松驰素类似物、编码所述人松驰素类似物的多核苷酸、其药物组合物及其在医药上的应用，还公开了所述人松驰素类似物的衍生物。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】人松驰素类似物、其药物组合物及其在医药上的应用
本公开涉及一种新型人松驰素类似物，包含其的药物组合物及其用途。
技术介绍
松弛素(Relaxin简称RLX)是一种多肽激素，其由哺乳动物的卵巢黄体分泌。松弛素在体内具有多种生理功能，包括松弛耻骨韧带、抑制子宫收缩、软化子宫颈、刺激乳腺发育、影响乳汁分泌。1926年，在研究妊娠期间骨盆带变化时，松弛素由FrederickHisaw首次发现。20世纪70至80年代，松弛素被认为是一种双链蛋白质。松弛素的结构与胰岛素相似。已经证实松弛素是肽类激素家族的成员之一。在人类当中，松弛素家族由7个基因所编码：RLN1、RLN2、RLN3(也作INSL7)、INSL3/RLF、INSL4/EPIL、INSL5/RIF2和INSL6/RIF1。人体循环中的大多数人类松弛素是基因RLN2编码的产物。RLN2的翻译产物是松弛素前体，该松弛素前体包括(从N端至C端)：24个氨基酸残基的信号肽序列、29个氨基酸残基的B链、104-107个氨基酸残基的连接序列，以及约24个氨基酸残基的A链。目前已明确，松弛素不仅在妊娠过程中发挥重要作用，而且对非妊娠动物的血管结构和功能也产生影响。松弛素具有广泛的生物学作用，包括在哺乳动物妊娠和机体老化过程中维持内环境的稳定、抗炎、心肌保护、扩张血管、促进伤口愈合，尤为重要的作用是抗纤维化。各种原因引起的心脏、肾脏病变最终均导致纤维化、结构改变、功能丧失的发生。因此，纤维化过程的有效抑制，是挽救脏器功能的重要措施。鉴于此，松弛素的抗纤维化作用可能成为未来抗纤维化治疗的有效措施。更为重要的是，松弛素可由心脏产生，并通过局部受体来保护心脏和调节细胞外基质。松弛素已成功地用于改善多种动物模型的心脏纤维化。因而，松弛素有望用于人类心脏纤维化性疾病的治疗(杜晓军，周娟，Baker心脏研究所)。现有技术中，在大肠杆菌中表达人松弛素(hRelaxin，野生型)前体；经过纯化后前体折叠复性；两步酶切(分别用CPB和胰蛋白酶)；再纯化得到有活性的产物松弛素。现有技术中的缺陷是：生产过程中需要蛋白复性、两步酶切和再纯化。繁多的步骤导致产量大大降低以及成本的提高，因为每一步都会涉及蛋白的损失。而且，外源酶(CPB、胰蛋白酶等)本身的成本高，酶的质量也会影响终产品的质量和产量。另一缺陷是，所表达的野生型松弛素活性低。这使得治疗剂量所需的重组蛋白的量增多，成本增加；而且所表达的野生型松弛素的低活性，给进一步开发蛋白修饰产品带来困难，因为修饰会损失蛋白的活性。针对现有技术的上述缺陷，通过对野生型松弛素的特定位点氨基酸改变，本公开进行了新型分子的设计，并发现了新型的人松弛素类似物，从而能非常好的解决上述问题。新的技术方案显示以下优点：1.松弛素特定位点的氨基酸改变，使所得的类似物能够在酵母细胞内完成正确的折叠，在这一过程中细胞自身的酶系统除去A和B链中的c-肽段。得到的完整有功能的活性分子被分泌到细胞外。通过一步纯化得到活性分子。省去现有技术所需的表达后复性、酶切、纯化等多个步骤。2.松弛素特定位点的氨基酸改变，使结构更加适应细胞内折叠、酶切和分泌，而且提高了生物学活性。这样可以减少单位剂量所需的重组蛋白质的量，从而降低成本。同时，因为活性提高，使得这样的类似物更加容易分子修饰物的开发。通过设计(松弛素序列中特定氨基酸的替换、缺失等)，本公开得到特定序列的人松驰素类似物。这种类似物能在真核表达系统(细胞)里完成松弛素前体的蛋白折叠、酶切；并且分泌到发酵液中时，本公开的人松驰素类似物是成熟的、完整、有功能的松弛素类似物。不仅如此，通过这些特定的设计所得到的松弛素类似物，其生物学活性比野生型松弛素高2倍以上。
技术实现思路
本公开提供一种人松弛素类似物，其包含A链和B链，所述A链和B链的氨基酸序列分别如下式所示：A链：A1LYSALANKCCHVGCTKRSLARFC(24个氨基酸残基)B链：DSWMEEVIKLCGRB14LVRAQIAICGMSTWS(29个氨基酸残基)其中A1选自：Q、D、E和W；其中B14选自：E、D和N；任选地，B1和B2同时缺失；当A1为Q时，B14不为E或D。在本公开的一个实施方案中，提供一种如上所述的人松弛素类似物，其包含A链和B链，所述A链和B链的氨基酸序列分别如下式所示：A链：A1LYSALANKCCHVGCTKRSLARFC(24个氨基酸残基)B链：DSWMEEVIKLCGRB14LVRAQIAICGMSTWS(29个氨基酸残基)其中A1选自：Q、D、E和W；其中B14选自：E、D和N；当A1为Q时，B14不为E或D。在本公开一个实施方案中，所述的A1为D、E或W，优选为D。在本公开一个实施方案中，所述的A1为D，B14为D。具体地，实例为SEQIDNO：134(A链)和SEQIDNO：135(B链)，通过二硫键连接而形成的人松弛素类似物。在本公开一个实施方案中，所述的B14为D。在本公开一个实施方案中，一种如上所述的人松弛素类似物，其中所述的A链和B链的氨基酸序列选自如下组合：在本公开一个实施方案中，一种如上所述的人松弛素类似物，其中所述B链通过连接序列(本公开中简称L)与所述A链连接，所述连接序列的长度为1至15个氨基酸残基，优选为2至8个氨基酸残基，所述的连接序列的氨基酸序列选自：在本公开一个实施方案中，一种如上所述的人松弛素类似物，其中所述的人松弛素类似物的N端连接有信号肽序列(本公开中简称S)，所述信号肽序列的长度为4至15个氨基酸残基，优选6至11个氨基酸残基；更优选的，所述的信号肽序列的氨基酸序列选自：S1：EEGEPK，SEQIDNO：33，S2：EEGEPKR，SEQIDNO：34，和S3：MKKNIAFLLKRSEQIDNO：35。在本公开一个实施方案中，一种用于制备如上所述的人松弛素类似物的表达前体，表达前体的氨基酸序列选自SEQIDNO：1至SEQIDNO：26的一种或多种。表1.人松弛素类似物表达前体汇总本公开进一步提供一种人松弛素类似物的衍生物，其是如上所述的人松弛素类似物经PEG化修饰所得，换言之其中如上所述的人松弛素类似物被PEG分子所修饰。在一些实施方案中，所述的PEG分子的分子量为5-100KDa；在一些实施方案中，是10-80KDa；在一些实施方案中，15-45KDa；在一些实施方案中，20-40KDa；在一些实施方案中，所述的PEG分子为支链型或直链型。本公开进一步提供一种多核苷酸，其编码如上所述的人松弛素类似物的表达前体。多核苷酸选自DNA或RNA。技术人员理解，多核苷酸的互补序列也涵盖在本公开的范围内。本公开进一步提供一种含有如上所述多核苷酸的表达载体。本公开进一步提供一种转化有如上所述的表达载体的宿主细胞。在一些实施方案中，所述的宿主细胞为细菌，在一些具体实施方案中为大肠杆菌；在另一些实施方案中，宿主细胞为酵母菌，在一些具体实施方案中为毕赤酵母。本公开进一步提供一种药物组合物，其含有或由如下组成：a)一种或多种如上所述的人松弛素类似物、和/或一种或多种如上所述的人松弛素类似物衍生物，和b)一种或多种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。本公开进一步提供一种人松弛素类似物或其衍生物的可注射溶液本文档来自技高网...
【技术保护点】
PCT国内申请，权利要求书已公开。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2013.11.07 CN 20131054822181.一种人松弛素类似物，其包含A链和B链，其中所述的B链和A链的氨基酸序列选自如下组合：B链DSWMEEVIKLCGRDLVRAQIAICGMSTWSSEQIDNO:137A链DLYSALANKCCHVGCTKRSLARFCSEQIDNO:138。2.如权利要求1所述的人松弛素类似物，其中所述B链通过连接序列与所述A链连接，所述连接序列的长度为1至15个氨基酸残基。3.如权利要求1所述的人松弛素类似物，其中所述B链通过连接序列与所述A链连接，所述连接序列的长度为2至8个氨基酸残基。4.如权利要求2所述的人松弛素类似物，其中所述的连接序列的氨基酸序列选自：5.如权利要求1所述的人松弛素类似物，其中所述的人松弛素类似物的N端连接有信号肽序列，所述信号肽序列的长度为4至15个氨基酸残基。6.如权利要求1所述的人松弛素类似物，其中所述的人松弛素类似物的N端连接有信号肽序列，所述信号肽序列的长度为6至11个氨基酸残基。7.如权利要求6所述的人松弛素类似物，其中所述的信号肽序列选自：S1：EEGEPK，SEQIDNO:33，S2：EEGEPKR，SEQIDNO:34，和S3：MKKNIAFLLKRSEQIDNO:35。8.一种人松弛素类似物衍生物，其中如权利要求1-7任一项所述的人松弛素类似物被PEG分子所修饰；所述的PEG分子的分子量为5-100KDa；所述的PEG分子为支链型或直链型。9.一种人松弛素类似物衍生物，其中如权利要求1-7任一项所述的人松弛素类似物被PEG分子所修饰；所述的PEG分子的分子量为10-80KDa；所述的PE...
【专利技术属性】
技术研发人员：张连山，刘佳建，曹国庆，
申请(专利权)人：上海恒瑞医药有限公司，江苏恒瑞医药股份有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31
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