本发明专利技术在使用TaqMan探针检测法的基础上，设计了两对高特异性扩增HLA‑B*15：02等位基因的引物探针组合。在此基础之上，使用内参基因β‑Actin的引物及探针，将两对目的基因特异性引物、探针与内参基因引物、探针加入同一管中进行多重荧光PCR反应，通过荧光扩增曲线分析结果。本发明专利技术具有特异性高、灵活快速、高通量、无污染、分辨率高、可实时监测反应进程等特点，可适用于人体外周血、唾液中全基因组DNA样本的HLA‑B*15:02等位基因的检测。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于药物基因诊断领域，具体涉及一种检测HLA-B*15:02等位基因的方法 及其引物以及探针设计。
技术介绍
HLA是指人类白细胞抗原，由人类第6号染色体短臂一群密切连锁的复等位基因 编码，包括100多个基因座位，现已发现9000多个等位基因，全长3600kb，是当前已知的人 类染色体中基因密度最高，也是多态性最为丰富的区域。世界卫生组织HLA因子命名委员 会命名的HLA等位基因已达到5000多个；鉴于HLA系统的高度多态性和复杂性，决定了HLA 等位基因的检测方法不同于普通多态性位点的检测。 卡马西平为三环类抗惊厥药，被广泛用于治疗癫痫、三叉神经、躁狂抑郁症等疾 病；由于这些药被广泛用于相应的病症治疗中，其不良反应也日益凸显。研宄表明，人类 白细胞抗原B家族的HLA-B*15:02基因和卡马西平（carbamazepineCBZ)药物所诱发的 StevensJohnson综合征（SJS)有很强的相关性。卡马西平所致的SJS患者中HLA位点等位 基因的出现频率增加，特别是HLA-B*15:02,几乎存在于100%卡马西平导致的SJS患者体 内，而在普通人群中只有8.6%的检出率。美国食品药品监督管理局$0八）将111^-8*15 :02 列为卡马西平诱导SJS-TEN的基因关联生物标记物，并告诫HLA-B*15:02等位基因阳性患 者服用卡马西平可能发生严重和潜在致命的皮肤不良反应，并推荐亚裔血统患者开始使用 卡马西平前，需进行HLA-B*15:02等位基因的检测。 目前常用HLA基因型检测方法主要有PCR-SSP(序列特异性引导的聚合酶链式反 应）、PCR-SBT(基于测序分型的聚合酶链式反应）和RT-PCR(荧光定量PCR反应）等检测 方法。其中PCR-SSP技术则需要进行凝胶电泳实验，因此该技术在操作过程中易造成二次 污染、时间长，同时在PCR过程中多对引物易造成二聚体等非目的基因产物，从而易造成假 阳性结果。PCR-SBT方法是对于HLA基因进行测序，从而确定具体HLA基因型，但其检测的 操作繁琐，耗时长，成本高昂，而且测序结果会出现套峰，不适合对于临床样本的快速指导。 而RT-PCR(荧光定量PCR反应）以高通量、快速简便，无污染，可实时监测反应进程等优点 已经成为HLA-B*15:02检测的主要手段。目前虽有基于RT-PCR方法的检测HLA-B*15:02 的试剂盒，但试剂盒涵盖的基因型较少，操作繁琐，要多管反应，容易出现假阳性和污染，远 远不能满足快速、简便、高特异性检测HLA-B*15:02基因的需求。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种高通量、特异性好，快速简便的检测HLA-B*15:02基因 型方法，有利于在HLA-B*15:02等位基因分型基础上指导卡马西平的安全用药。 本专利技术提供的定性HLA_B*15:02基因的TaqMan探针检测方法，首先通过与HLA-B 其它同源性等位基因序列对比。根据序列比对结果，发现HLA-B*15:02与多个HLA-B等位 基因具有很高的同源性，尤其是HLA-B*15等位基因，而这些特异性的位点分布在多个外显 子和内含子区域中。因此，为了保证HLA-B*15:02检测方法的特异性，至少需要设计两对特 异性引物和探针，其中第一对特异性引物（上游引物为ARMS引物）和探针分布在外显子 2和内含子2区域中，扩增的DNA片段长度为132bp，第二对特异性引物（下游引物为ARMS 引物）和探针分布在外显子5和内含子5区域中，扩增的DNA片段长度为125bp;本专利技术结 合等位基因阻滞突变系统（ARMS)的方法，设计TaqMan探针检测的特异性引物以及探针， 值得注意的是探针和引物设计的位置基本能够排除其它HLA-B等位基因的结合、识别。采 用三重通道荧光检测法将两对特异性引物与探针以及内参基因的引物与探针加入同一反 应管中，在荧光PCR仪上扩增DNA片段，通过扩增曲线分析结果，来判断未知样本是否携带 HLA-B*15:02等位基因。 为实现以上专利技术目的，本专利技术所提供的检测人类白细胞抗原HLA-B*15:02基因型 的技术方案如下：第一条上游引物Fpl:5' -GACCGGACCACACAGATCCC-3'第一条下游引物Rpl:5' -ATGGGGAGTCGTGACCTG-3'第一条探针probel:5'-HEX-ACCTGCGCGGCTACTACAACC-BHQ2-3'；第二条上游引物Fp2 :5' -TGATGTGTAGGAGGAAGAGC-3' 第二条下游引物Rp2:5' -AACCATCAAGGCGATACATGTG-3'第二条探针probe2 :5' -Cy5-TGTGAGGATGCTTCCCA-BHQ2-3'其中，HEX为 6-carboxy-hexachlorofluorescein;Cy5 为Cyanine5 ;BHQ2 为Black HoleQuencher-2〇 该检测方法主要包括以下环节： (1)针对HLA-B*15:02等位基因设计特异性引物和探针，按照权利要求1所述的引 物探针组合；并设计内参基因的引物和探针； (2)获得抽提的待测样本基因组DNA ; (3)在同一个反应体系中，将待测样本基因组DNA与所述引物探针组合以及内参 基因的引物和探针按照确定比例混合； (4)通过AppliedBiosystem7500或者LightCyclerSystem480进行实时定量焚 光PCR检测，其中分别利用FAM、HEX/VIC和Cy5荧光通道进行多通道荧光采集； (5)分析判断待测样本是否携带HLA-B*15:02等位基因。 基于上述方案，本专利技术还进一步作如下优化设计： 环节（1)中设计内参基因0-actin引物和探针为：上游引物Actin-F: 5' -CAGCAGATGTGGATCAGCAAG-3'下游引物Actin-R:5' -GCAITTGCGGTGGACGAT-3'探针probe: 5 ' -FAM-AGGAGTATGACGAGTCCGGCCCC-BHQ2-3 '其中，FAM为6-carboxyfluorescein〇 使用Premix Ex Taq试剂盒（TaKaRa)进行扩增，所述反应体系以20 y L计，贝丨J包 括：10yL Premix Ex Taq(2X)，HLA-B*15:02特异性第一条上游引物Fpl:50nM，第一条下 游引物Rpl:50nM，第一条特异性探针probel:50nM，第二条上游引物Fp2:100nM，第二条下 游引物Rp2:100nM，第二条特异性探针probe2:50nM以及0-Actin基因特异性上游引物 Fp:50nM，下游引物Rp:50nM，探针probe:50nM ;然后加入待测样本基因组DNA约10ng，补充 PCR等级的水至终体积20yL;扩增程序为：95°C预变性30s;95°C5s~10sec，60°C34s~ 40sec，共计35~40个循环。目的基因和内参基因的特异性引物和探针在荧光PCR仪上加入同一管中进行扩 增，但是用三个通道进行荧光的采集；内参基因作为质控，必须出现荧光扩增曲线；在内 参基因观察到扩增曲线的前提下，特异性探针必须同时扩增到本文档来自技高网...
【技术保护点】
用于多重荧光PCR反应高特异性扩增HLA‑B*15:02等位基因的特异性引物探针组合，其特征在于，包括以下引物和探针序列：第一条上游引物Fp1:5’‑GACCGGACCACACAGATCCC‑3’第一条下游引物Rp1:5’‑ATGGGGAGTCGTGACCTG‑3’第一条探针probe1：5’‑HEX‑ACCTGCGCGGCTACTACAACC‑BHQ2‑3’；第二条上游引物Fp2：5’‑TGATGTGTAGGAGGAAGAGC‑3’第二条下游引物Rp2:5’‑AACCATCAAGGCGATACATGTG‑3’第二条探针probe2：5’‑Cy5‑TGTGAGGATGCTTCCCA‑BHQ2‑3’其中，HEX为6‑carboxy‑hexachlorofluorescein；Cy5为Cyanine5；BHQ2为Black Hole Quencher‑2。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王会娟，康星，陈融，刘正斌，韩敏，周少荷，陈超，
申请(专利权)人：陕西佰美基因股份有限公司，
类型：发明
国别省市：陕西;61
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