一种血清miRNA生物标志物的应用制造技术

一种血清miRNA生物标志物的应用，涉及生物标志物。所述血清miRNA生物标志物包括miR-34c、miR-1275、miR-375、miR-410、miR-758中的至少一种。所述血清miRNA生物标志物可在制备少精症和无精症检测试剂中应用。所述血清miRNA生物标志物组合物包括miRNA中的至少一种以及各miRNA的反转录引物、正向引物和反向引物的序列；所述血清miRNA生物标志物组合物可在制备少精症和无精症检测试剂中应用。确定的miRNA组合与少精症和无精症的病例指标的密切相关性，能够作为生物标记物对少精症和无精症病人进行筛查和诊断，为临床个体化干预治疗提供有效依据。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物标志物，尤其是涉及一种血清miRNA生物标志物的应用。技术背景不孕不育是全球性医学问题，据世界卫生组织统计，全球约有5％～10％的育龄夫妻存在不孕不育问题，其中男性原因所致不育占一半左右。有90％的男性不育症是由生精障碍引起，临床上表现为无精子症或少精子症。少精症是指每毫升精液中精子少于2000万，因为精子数量少，与卵子相遇的机会就少，导致男性不育。无精症约占男性不育症患者的15％～20％。无精症是指多次精液检查(一般3次以上)均未发现精子。无精症患者必要时可做睾丸活检、精道造影、内分泌激素放免测定等，以协助鉴别阻塞性无精子或先天性无精子。目前相关研究大多从单个基因的角度探讨少精症和无精症的病因，但单个基因的改变并不能完全解释他们的致病机制。miRNA(microRNA)是一类长约22nt的非编码小RNA，广泛存在于各种生物中，调节生物体生长、发育和凋亡等过程。由此形成的复杂遗传学网络，是生物体生长发育的基础。miRNA在人和动物睾丸发育及精子生成等过程也起着重要的调控作用。研究报道在成年果蝇体内去除一个miRNA(let-7)，就能导致不孕不育。因为像let-7这样的miRNA承担了重要的功能，在进化中非常保守，广泛存在于人类和许多其他动物体内(Fagegaltier D,A,Gordon A,et al.A genome-wide survey of sexually dimorphic expression of Drosophila miRNAs identifies the steroid hormone-induced miRNA let-7as a regulator of sexual identity[J].Genetics,2014,198(2):647-668.)。miRNA在血清中可长期稳定存在，耐RNA酶降解，煮沸、反复冻融、酸碱环境、长期保存等各种处理方法均不会造成血清miRNA的损失，因此血清中的miRNA有潜力作为一种有价值的筛查或者诊断的标志物，其受外来干扰因素影响小，临床实用性强。甚至常规体检中就可以收集到的血液。由于血液会循环至全身所有组织，向细胞输送营养并清除废物，因此血液能够反映出整个机体的生理病理状况，其检测结果对人体健康具有指导意义。并且，基于血清的检测是无创的、非侵入的，因此可以适用于普查，为早期诊断服务。少精症和无精症患者血清的miRNA检查不仅可以辅助诊断，避免进行睾丸活检等创伤性检查，或者一些无效的治疗，更主要的是可以避免将这种缺陷遗传给下一代。由于血清中miRNA的表达量较低，寻找一种灵敏度高、操作简便且成本低廉的检测方法是目前血清miRNA应用于临床检测亟待解决的问题，实时荧光定量PCR是目前检测血清miRNA的主要方法，该方法快速、便捷，精确度和灵敏度可满足临床需求。另外，在选择标志物时，应优先选择在疾病中表达上调的血清miRNA，这样也可提高检测的灵敏性和特异性。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种血清miRNA生物标志物的应用。所述血清miRNA生物标志物包括以下所列miRNA中的至少一种：miR-34c：aggcaguguaguuagcugauugc；miR-1275：gugggggagaggcuguc；miR-375：uuuguucguucggcucgcguga；miR-410：agguugucugugaugaguucg；miR-758：gaugguugaccagagagcacac。所述血清miRNA生物标志物可在制备少精症和无精症检测试剂中应用。所述血清miRNA生物标志物组合物包括miRNA中的至少一种以及各miRNA的反转录引物、正向引物和反向引物的序列；所述miRNA包括：miR-34c：aggcaguguaguuagcugauugc；miR-1275：gugggggagaggcuguc；miR-375：uuuguucguucggcucgcguga；miR-410：agguugucugugaugaguucg；miR-758：gaugguugaccagagagcacac；所述各miRNA的反转录引物、正向引物和反向引物的序列如下表所示：所述血清miRNA生物标志物组合物可在制备少精症和无精症检测试剂中应用。所述少精症和无精症检测试剂用于检测少精症和无精症的方法采用茎环的反转录-荧光定量PCR方法，即SYBR Green染料法，具体步骤如下：1)血清样本采集和临床分组：从医院采集血清样本，同时系统收集患者的病理学资料；2)用Qiagen公司商品化的总RNA提取试剂盒miRNeasy Serum/Plasma kit(cat.no.217184)从受试样本血清中提取总RNA，通过Agilent miRNA microarray高通量筛选出候选miRNA；3)采用实时荧光定量PCR方法筛选可用作检测标志物的miRNA。本专利技术使用的检测方法可以选自：RT-PCR方法、Microarray技术、Real-time PCR方法等中的至少一种。本专利技术具有以下技术效果：首先，血清相对其它组织样本较易获得，与睾丸活检或者睾丸穿刺相比，来源方便性能稳定，而且属于无创性检查检，极大地方便了医疗人员的使用，减轻了患者的痛苦。其次，本专利技术确定的miRNA组合与少精症和无精症的病例指标的密切相关性，能够作为生物标记物对少精症和无精症病人进行筛查和诊断，为临床个体化干预治疗提供有效依据。最后，通过实时荧光定量PCR技术对少精症和无精症病人的血清水平miRNA的检测，定量准确，方便可靠。本专利技术确定的miRNA组合与少精症和无精症的病例指标的密切相关性，能够作为生物标记物对少精症和无精症病人进行筛查和诊断，为临床个体化干预治疗提供有效依据。为今后少精症和无精症血清miRNA的研究提供了理论依据，并为少精症和无精症的分子诊断提供了新思想，具有一定的理论意义和潜在的实用价值。本专利技术还同时提供了一种用于少精症和无精症检测的荧光定量检测引物组合物，该引物组合物包括所述血清miRNA组合物中各miRNA的检测引物。附图说明图1是本专利技术miRNA生物标志物筛选的主要流程图。图2是显示miR-34c在少精症患者、无精症患者和正常对照组中表达存在明显差异对比图。图3是显示miR-1275在少精症患者、无精症患者和正常对照组中表达存在明显差异对比图。图4是显示miR-375在少精症患者、无精症患者和正常对照组中表达存在明显差本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种血清miRNA生物标志物，其特征在于包括以下所列miRNA中的至少一种：miR‑34c：aggcaguguaguuagcugauugc；miR‑1275：gugggggagaggcuguc；miR‑375：uuuguucguucggcucgcguga；miR‑410：agguugucugugaugaguucg；miR‑758：gaugguugaccagagagcacac。

【技术特征摘要】
1.一种血清miRNA生物标志物，其特征在于包括以下所列miRNA中的至少一种：
miR-34c：aggcaguguaguuagcugauugc；
miR-1275：gugggggagaggcuguc；
miR-375：uuuguucguucggcucgcguga；
miR-410：agguugucugugaugaguucg；
miR-758：gaugguugaccagagagcacac。
2.如权利要求1所述血清miRNA生物标志物在制备少精症和无精症检测试剂中应用。
3.如权利要求2所述应用，其特征在于所述少精症和无精症检测试剂用于检测少精症和
无精症的方法采用茎环的反转录-荧光定量PCR方法，即SYBR Green染料法，具体步骤如下：
1)血清样本采集和临床分组：从医院采集血清样本，同时系统收集患者的病理学资料；
2)用Qiagen公司商品化的总RNA提取试剂盒miRNeasy Serum/Plasma kit(cat.no....

【专利技术属性】
技术研发人员：曾骥孟，李志明，顾龙，庄炫，
申请(专利权)人：厦门大学，
类型：发明
国别省市：福建;35