三维DNA纳米结构、电化学生物传感器及其制备方法和应用技术

本发明专利技术涉及三维DNA纳米结构、电化学生物传感器及其制备方法和应用。所述三维DNA纳米结构为六面体结构，且所述六面体结构可通过与不同目标分子相结合而发生结构转变并导致电化学信号转变。所述三维DNA纳米结构单元底面四个顶点通过自组装作用固载在金电极表面。本发明专利技术将该DNA纳米结构组装在电极表面构置了新型电化学生物传感器，六面体结构的DNA具有高特异性识别目标分子和高稳定性的特性，提高了电化学生物传感器的分析性能；本发明专利技术所构置的电化学生物传感器可通过替换DNA链实现凝血酶、溶菌酶等不同待测物的检测，应用范围广泛。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于电化学
，具体涉及一种三维DNA纳米结构、基于所述三维DNA纳米结构的电化学生物传感器及其制备方法和应用。
技术介绍
DNA电化学生物传感器是一种利用DNA分子卓越的自组装和识别能力，由固定化的生物敏感材料核酸作识别元件与电极及信号放大装置构成的分析工具或系统。由于其具有灵敏度高、成本低、易于微型化等特点已成为目前分析化学研究中最活跃的领域之一。然而，采用一维(单链DNA)或二维结构(如发夹结构)DNA作为识别元件，其传感界面的均一性在制备过程中难以得到有效控制，尤其是其稳定性仍不高，因而影响了传感器分析特性的提高以及在实际检测中的应用前景。三维结构DNA探针由于具有高结构稳定性和刚性，能在电极表面实现精确的纳米构筑，因而可以有效提高DNA探针在表面分布排列的均一性，精确调控探针之间的距离，为具有优异分析特性的新型生物传感平台的功能设计注入了新的活力，并成为电分析发展的最前沿。为了实现基于三维DNA纳米结构的生物传感界面的构筑，首先需要建立高特异性、高稳定性的三维DNA纳米结构，而组装效率和结构稳定性是该研究中的关键因素之一。研究发现，组装效率会随着目标结构的尺寸降低而增加，四面体结构的组装效率可达90％，而十二面体的组装效率降低为76％，对于巴克球结构其组装效率仅69％，表明形成三维DNA的结构越复杂就需要越多的结节，且组装效率也相应降低。若利用一条由286个核苷酸组成的DNA链在体组装成为具有四面体结构的DNA纳米结构，可简化组装过程并消除了配比影响，从而提高了三维DNA的组装效率，并具有易扩增、易制备、稳定性高等特点。最近，人们发现利用DNA组装形成的机械强度与结构稳定性高的“金字塔”状DNA四面体结构非常适用于将生物分子固定在电极表面，从而构建新型生物传感界面，并且组装效率也提高至85％。然而，一个理想的分析体系，不仅应该具有高灵敏的优点，还应该具有可控的功能以实现复杂体系中高选择性检测、高稳定性的优点。与基于一维和二维DNA纳米结构的生物传感器相比，虽然一维和二维DNA纳米结构DNA序列在识别目标物时具有很高的特异性，但仍非常容易受到剩余序列部分的背景干扰、核酸降解以及非特异性建合等干扰，尤其是针对复杂生物环境下的基因检测。
技术实现思路
针对现有技术的缺陷或不足，本专利技术的目的之一是提供一种三维DNA纳米结构。为此，本专利技术的三维DNA纳米结构，其P1、P2、P3和P4四条链，其中：5'端到3'端P1链的组成为：P1标记碳链、P1骨架DNA序列、P1非目标识别DNA序列、P1转角DNA序列、目标一识别DNA序列、P1电化学标记DNA序列；5'端到3'端P2链的组成为：P2标记碳链、P2骨架DNA序列、与目标二识别DNA序列杂交的DNA序列、P2转角DNA序列、与P1非目标识别DNA序列杂交的DNA序列、P2电化学标记DNA序列；5'端到3'端P3链的组成为：P3标记碳链、P3骨架DNA序列、与目标一识别DNA序列杂交的DNA序列、P3转角DNA序列、P3非目标识别DNA序列、P3电化学标记DNA序列；5'端到3'端P3链的组成为：P4标记碳链、P4骨架DNA序列、与P3非目标识别DNA序列杂交的DNA序列、P4转角DNA序列、目标二识别DNA序列、P3电化学标记DNA序列；所述P1、P2、P3和P4四条链之间匹配连接组成三维六面体DNA纳米结构。优选的，所述P1标记碳链、P2标记碳链、P3标记碳链、P4标记碳链均为HS-C6；所述P1、P2、P3和P4四条链的骨架DNA序列均为4～30个A或T碱基，且四条链的骨架DNA序列相同；所述目标一识别DNA序列为对待测物一具有特异性识别的适体链，其长度为15～60个碱基构成；所述目标二识别DNA序列为对待测物二具有特异性识别的适体链，其长度为15～60个碱基构成；所述P1转角DNA序列、P2转角DNA序列、P3转角DNA序列、P4转角DNA序列均由2～4个A或T碱基构成，四条链的转角DNA序列相同或不同；所述P1非目标识别DNA序列为15～60个碱基；所述P3非目标识别DNA序列为15～60个碱基；P1非目标识别DNA序列与P3非目标识别DNA序列相同或不同；所述四条链的电化学标记DNA序列为二茂铁DNA序列、联吡啶钌DNA序列、亚甲基蓝DNA序列、过氧化物酶DNA序列或葡萄糖氧化酶DNA序列，且四条链的电化学标记DNA序列相同或不同。上述三维DNA纳米结构的制备方法，该制备方法包括：将含有P1链、P2链、P3链、P4链、氯化镁和氯化钠的混合溶液置于75～95℃条件下处理适当时间后，再在4℃条件下处理适宜的时间得到六面体DNA纳米结构。优选的，混合溶液中P1链的浓度均为0.1×10–6mol·L–1～5.0×10–6mol·L–1；P2链的浓度均为0.1×10–6mol·L–1～5.0×10–6mol·L–1；P3链的浓度均为0.1×10–6mol·L–1～5.0×10–6mol·L–1；P4链的浓度均为0.1×10–6mol·L–1～5.0×10–6mol·L–1；四条链的浓度相同或不同，氯化镁的浓度为10～50.0mM；氯化钠的浓度为0.1～0.5M75～95℃条件下处理30秒～2分钟，4℃条件下处理5秒～30秒。针对现有技术的缺陷或不足，本专利技术的又一目的是提供一种基于三维DNA纳米结构的电化学生物传感器的制备方法。为此，本专利技术提供的基于三维DNA纳米结构的电化学生物传感器的制备方法包括：将金电极置于权利要求1-2中任一权利要求所述六面体DNA纳米结构的溶液中，避光条件下反应后得到电化学生物传感器。优选的，将金电极置于上述含有0.1×10–6mol·L–1～5.0×10–6mol·L–1的六面体DNA纳米结构的溶液中，避光震荡条件下反应一段0.5-10小时，用含有0.1～0.5M NaCl的10.0mM、pH 7.4的TE缓冲液淋洗后即得到电化学生物传感器。本专利技术所使用的金电极为内径1mm的金盘电极，电极表观面积约为0.785mm2。具体的，所述四条P1、P2、P3和P4DNA链分别为：P1：5'-HS-C6-TTTTTTTTTTTTTATCACCAGGCAGTTGATTGGTTGGTGTGGTTGGTTT-Fc-3’；P2：5'-HS-C6-TTTTTTTTTTTTCTAA本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种三维DNA纳米结构，其特征在于，其包括P1、P2、P3和P4四条链，其中：5′端到3′端P1链的组成为：P1标记碳链、P1骨架DNA序列、P1非目标识别DNA序列、P1转角DNA序列、目标一识别DNA序列、P1电化学标记DNA序列；5′端到3′端P2链的组成为：P2标记碳链、P2骨架DNA序列、与目标二识别DNA序列杂交的DNA序列、P2转角DNA序列、与P1非目标识别DNA序列杂交的DNA序列、P2电化学标记DNA序列；5′端到3′端P3链的组成为：P3标记碳链、P3骨架DNA序列、与目标一识别DNA序列杂交的DNA序列、P3转角DNA序列、P3非目标识别DNA序列、P3电化学标记DNA序列；5′端到3′端P3链的组成为：P4标记碳链、P4骨架DNA序列、与P3非目标识别DNA序列杂交的DNA序列、P4转角DNA序列、目标二识别DNA序列、P3电化学标记DNA序列；所述P1、P2、P3和P4四条链之间匹配连接组成三维六面体DNA纳米结构。

【技术特征摘要】
1.一种三维DNA纳米结构，其特征在于，其包括P1、P2、P3和P4四
条链，其中：
5′端到3′端P1链的组成为：P1标记碳链、P1骨架DNA序列、P1非目标识
别DNA序列、P1转角DNA序列、目标一识别DNA序列、P1电化学标记DNA序
列；
5′端到3′端P2链的组成为：P2标记碳链、P2骨架DNA序列、与目标二识
别DNA序列杂交的DNA序列、P2转角DNA序列、与P1非目标识别DNA序列杂
交的DNA序列、P2电化学标记DNA序列；
5′端到3′端P3链的组成为：P3标记碳链、P3骨架DNA序列、与目标一识
别DNA序列杂交的DNA序列、P3转角DNA序列、P3非目标识别DNA序列、P3
电化学标记DNA序列；
5′端到3′端P3链的组成为：P4标记碳链、P4骨架DNA序列、与P3非目标
识别DNA序列杂交的DNA序列、P4转角DNA序列、目标二识别DNA序列、P3
电化学标记DNA序列；
所述P1、P2、P3和P4四条链之间匹配连接组成三维六面体DNA纳米结
构。
2.如权利要求1所述的三维DNA纳米结构，其特征在于，
所述P1标记碳链、P2标记碳链、P3标记碳链、P4标记碳链均为HS-C6；
所述P1、P2、P3和P4四条链的骨架DNA序列均为4～30个A或T碱
基，且四条链的骨架DNA序列相同；
所述目标一识别DNA序列为对待测物一具有特异性识别的适体链，其长度
为15～60个碱基构成；
所述目标二识别DNA序列为对待测物二具有特异性识别的适体链，其长度
为15～60个碱基构成；
所述P1转角DNA序列、P2转角DNA序列、P3转角DNA序列、P4转角DNA
序列均由2～4个A或T碱基构成，且四条链的转角DNA序列相同；
所述P1非目标识别DNA序列为15～60个碱基；
所述P3非目标识别DNA序列为15～60个碱基；
P1非目标识别DNA序列与P3非目标识别DNA序列相同；
所述四条链的电化学标记DNA序列为二茂铁DNA序列、联吡啶钌DNA序列、
亚甲基蓝DNA序列、过氧化物酶DNA序列或葡萄糖氧化酶DNA序列，且四条链
的电化学标记DNA序列相同。
3.如权利要求1所述的三维DNA纳米结构，其特征在于：
所述四条P1链、P2链、P3链和P4链序列分别为：
P1：
5′-HS-C6-TTTTTTTTTTTTTATCACCAGGCAGTTGATTGGTTGGTGTGG
TTGGTTT-Fc-3’；
P2：
5′-HS-C6-TTTTTTTTTTTTCTAAGTAACTCTGCACTCTTTAGCCCTGAT
TTTCAACTGCCTGGTGATATTT-Fc-3’；
P3：
5′-HS-C6-TTTTTTTTTTTTCCAACCACACCAACCTTTTCAGACTTAGGA
ATGTTTT-Ru(bpy)32+-3’；
P4：
5′-HS-C6-TTTTTTTTTTTTACATTCCTAAGTCTGAATTATCAGGGCTAA

\tAGAGTGCAGAGTTACTTAGTTT-Ru(b...

【专利技术属性】
技术研发人员：盛庆林，刘江涛，张赛，武倩，聂菲，郑建斌，
申请(专利权)人：西北大学，
类型：发明
国别省市：陕西;61