用于改善重构后纯化的因子VIII的稳定性的方法技术

本发明专利技术涉及一种用于增加因子VIII分子在纯化、冻干和重构后的稳定性的方法，所述方法包括在制造因子VIII分子期间自始至终防止将因子VIII分子经蛋白酶剪切成基本上包含A1结构域和A2结构域的第一片段和基本上包含A3结构域、C1结构域和C2结构域的第二片段。本发明专利技术还涉及用于改善静脉内和非静脉内注射后因子VIII的生物利用率的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于改善重构后纯化的因子VIII的稳定性的方法本专利技术涉及一种用于增加因子VIII分子在纯化、冻干和重构后的稳定性的方法，所述方法包括在制造因子VIII分子期间自始至终防止将因子VIII分子经蛋白酶剪切成基本上包含A1结构域和A2结构域的第一片段和基本上包含A3结构域、C1结构域和C2结构域的第二片段。本专利技术还涉及用于改善静脉内和非静脉内注射后因子VIII的生物利用率的方法。
技术介绍
经典的血友病或血友病A是一种遗传性出血障碍。它因染色体X连锁的凝血因子VIII缺陷所致，并且几乎排他地侵袭男性，发病率为每10,000人在一位和两位个体之间。X-染色体缺陷由本身不是血友病患者的女性携带者传递。血友病A的临床表现是增加的出血倾向性。在引入因子VIII浓缩物治疗之前，患有严重血友病的人的平均寿命短于20年。使用来自血浆的因子VIII的浓缩物已经明显地改善血友病患者的状况，广泛地增加平均寿命，给予大部分患者过上或多或少正常生活的可能性。然而，伴随血浆衍生的浓缩物和它们的使用，存在某些问题，其中最严重的问题是传播病毒。迄今，造成AIDS、乙型肝炎和非甲非乙肝炎的病毒已经严重袭击该群体。从那时起，已经新近开发了不同的病毒灭活方法和新的高度纯化的因子VIII浓缩物，它们还对血浆衍生的因子VIII建立了极高的安全性标准。几种重组和血浆衍生的治疗性多肽，例如凝血因子，可商业获得用于人类中的治疗性和预防性使用。FVIII是一种在哺乳动物肝脏中产生的分子量直到约280kDa的血浆糖蛋白。它是导致凝血的凝血反应级联的关键组分。在这个级联内部存在其中因子IXa(FIXa)连同激活的因子VIII(FVIIIa)一起使因子X(FX)转化成激活形式FXa的步骤。FVIIIa在这个步骤充当辅因子，与钙离子和磷脂是最大化FIXa活性所要求的。治疗血友病A方面的一项重要进展是分离了编码2,351个氨基酸的人FVIII完整序列的cDNA克隆(美国专利号4,757,006)和提供人FVIII基因DNA序列及用于其生产的重组方法。将因子VIII合成为具有分子量约280kDa的单条多肽链。当因子VIII转运入内质网时，移除氨基端信号肽，并且成熟(即切除信号肽后)天然因子VIII分子随后在其分泌过程中在第1313和1648位氨基酸残基后以蛋白酶解方式被切割。这导致释放异二聚体，所述异二聚体由按金属离子依赖性方式与约160-200kDaN端重链片段缔合的约80kDaC端轻链组成。(综述见Kaufman,TransfusionMed.Revs.6:235(1992))。通过凝血酶对蛋白质链的蛋白酶切割，该异二聚体的生理激活发生。凝血酶将重链切割成90kDa蛋白质并随后切割成54kDa和44kDa片段。凝血酶还将80kDa轻链切割成72kDa蛋白质。正是后一种蛋白质和由钙离子结合在一起的两个重链片段(上文54kDa和44kDa片段)才构成活性FVIII。当44kDaA2重链片段从该分子解离或当72kDa和54kDa蛋白质由凝血酶、活化的蛋白C或FXa进一步切割时，失活发生。在血浆中，FVIII通过与50倍摩尔过量的VWF蛋白(“VWF”)缔合稳定，所述VWF蛋白似乎抑制蛋白酶解性破坏如上文所述的FVIII。FVIII的氨基酸序列组织成三个结构域：330个氨基酸的三重A结构域、980个氨基酸的单个B结构域和150个氨基酸的重复C结构域。B结构域与其他蛋白质没有同源性并且提供这种蛋白质的25个潜在天冬酰胺(N)联糖基化位点中的18个。B结构域在凝血中明显没有功能并且可以缺失，而B-结构域缺失的FVIII分子仍具有促凝血活性。市场上的因子VIII产品目前作为因子VIII冻干制剂提供或者通过重组技术产生或从汇集的血浆纯化。冻干产品在施用之前重构。一旦重构，因子VIII的货架期相对短暂。因子VIII是相对不稳定的蛋白质，特别在水溶液中。已经描述在制造和储存期间通过与其他血浆蛋白复合、特别与血管性血友病因子(vWF)和白蛋白复合的稳定化作用见，例如，美国专利号6,228,613。美国专利号5,565,427公开了包含一个氨基酸的因子VIII或其盐或同源物之一及去垢剂或有机聚合物如聚乙二醇的稳定化制剂。美国专利号5,605,884公开了在氯化钙和高浓度氯化钠或氯化钾存在的情况下因子VIII在基于组氨酸缓冲液的高离子强度介质中的稳定化制剂。这类组合物显示显著地改善重构后含水形式的因子VIII的稳定性。通常认可了钙离子在因子VIII制剂中的重要性。根据美国专利号6,599,724，其他二价阳离子即Cu2+和Zn2+的存在，任选地在Ca2+离子或Mn2+离子存在的情况下，改善因子VIII的稳定性。WO2011/027152A1还描述了包含各种添加物的稳定的含水因子VIII组合物。考虑到冻干物重构后因子VIII的短货架期，需要增加重构的因子VIII在水溶液中稳定性的方法。出于不同原因，提供在液相具有增加的稳定性的纯化FVIII制备物是合乎需要的。首先，优点是在环境温度具有支持在环境温度制造纯化FVIII产物的足够时间跨度。具体而言，填充步骤需要储存某种液体散货以增加制造灵活性。其次，如果产品不能在重构后直接施加，液态的纯化FVIII的稳定性增加将对医师和患者而言是有优势的。并且最终，在连续输注条件下例如在住院患者中手术时使用FVIII取决于重构后优选高的产物稳定性(TakedaniH.,Haemophilia2010,16:740-746)。具有增加的稳定性的FVIII分子还将有利于开发适于液态条件下长期储存的FVIII制备物。本申请的专利技术人令人惊讶地发现冻干物重构后纯化因子VIII的稳定性在单链因子VIII构建体中实质地增强。这类构建体可以通过阻止蛋白酶剪切获得，所述蛋白酶剪切一般在因子VIII分泌之前出现在高尔基体区室中。单链构建体在纯化后在溶液中显示更好的稳定性/或当皮下施用时显示更好的生物利用率。专利技术简述在第一方面，本专利技术涉及一种用于增加因子VIII分子在纯化、冻干和重构后的稳定性的方法，所述方法包括防止将因子VIII分子经蛋白酶剪切成基本上包含A1结构域和A2结构域的第一片段和基本上包含A3结构域、C1结构域和C2结构域的第二片段。第一方面涵盖一种用于增加因子VIII分子在纯化、冻干和重构后的稳定性的方法，所述方法包括在制造因子VIII分子期间自始至终防止将因子VIII分子经蛋白酶剪切成基本上包含A1结构域和A2结构域的第一片段和基本上包含A3结构域、C1结构域和C2结构域的第二片段。第一方面进一步涵盖一种用于增加因子VIII分子在纯化、冻干和重构后的稳定性的方法，所述方法包括在纯化因子VIII分子之前防止将因子VIII分子经蛋白酶剪切成基本上包含A1结构域和A2结构域的第一片段和基本上包含A3结构域、C1结构域和C2结构域的第二片段。就本专利技术的这些方法而言，术语“在制造因子VIII分子期间自始至终”和“在纯化因子VIII分子之前”意指本专利技术的方法防止将因子VIII切割成基本上包含A1结构域和A2结构域的第一片段和基本上包含A3结构域、C1结构域和C2结构域的第二片段，但是本专利技术的方法不阻止可以在施用重构的因子VIII分子后发生的因子VIII活化切割。通本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于增加因子VIII分子在纯化、冻干和重构后的稳定性的方法，所述方法包括在制造因子VIII分子期间自始至终防止将因子VIII分子经蛋白酶剪切成基本上包含A1结构域和A2结构域的第一片段和基本上包含A3结构域、C1结构域和C2结构域的第二片段。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2011.10.18 EP 11185651.4;2011.10.18 US 61/548,6011.一种相对于人野生型因子VIII，改善因子VIII分子在静脉内和非静脉内施用后的血浆半寿期的方法，所述方法包括失活Arg1648和Glu1649之间的蛋白酶剪切位点，并且，如果...

【专利技术属性】
技术研发人员：C·霍恩，S·措尔纳，H·梅茨纳，S·舒尔特，
申请(专利权)人：CSL有限公司，
类型：发明
国别省市：澳大利亚;AU