一种循环超滤-盐析结晶分离精制卵清溶菌酶的方法技术

本发明专利技术提供一种应用循环超滤－盐析结晶分离精制卵清溶菌酶的方法。首先对卵清进行稀释、微滤和超滤等预处理，获得卵清溶菌酶原料液；原料液循环流经切向流超滤器中的膜组件，卵清溶菌酶溶液得到不断分离和浓缩；再利用超滤和盐析结晶集成进一步浓缩卵清溶菌酶溶液；卵清溶菌酶溶液在结晶罐中盐析结晶。应用本发明专利技术方法，所获得的溶菌酶晶体粒径大于０．１ｍｍ，粒度均匀、形貌完整，具有典型的晶体Ｘ－射线衍射峰；比活力可达２０，０００Ｕ／ｍｇ以上，酶回收率可达７０％以上，纯化因子达２５．１。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种卵清溶菌酶的分离纯化方法，具体涉及一种循环超滤-盐析结晶分离精 制卵清溶菌酶的方法。
技术介绍
卵清溶菌酶是一种典型的蛋白质，目前在医疗、食品和生物工程上已有广泛的应用。 随着各种新的生物分离技术的出现，用于溶菌酶分离纯化的方法也愈来愈多，从最初的直 接结晶法、沉淀法到亲和色谱法、离子交换法、超滤膜分离等。目前，常用的卵清溶菌酶 生产方法是离子交换法，但卵清溶菌酶的得率和酶活都不太理想。超滤膜分离技术是一种 非加热分离技术，具有无相变、能耗低和分离效率高的特点，对于分离生物大分子具有极 大的优越性。此外，超滤膜分离还具有操作方便、结构紧凑、维修费用较低、易于自动化 的特点。而采用超滤膜分离技术进行卵清溶菌酶的分离浓縮，收率高且极少破坏。但是， 超滤膜分离应用于卵清溶菌酶的分离还得克服浓差极化、通量衰减等问题。结晶是一个很 重要的化工单元操作，能从杂质相当多的溶液中获得纯度很高的晶体，同时所用的设备简 单，操作方便。对于许多物质来说，结晶往往是从不纯混合物或不纯溶液中制取纯品的一 个最便宜的单元操作，也是工业化生产中最经济的方法。但是，盐析结晶法生产卵清溶菌 酶结晶助剂耗用量大、晶体粒度小、杂质含量较高、难以达到纯度及晶形要求等问题。循环超滤一盐析结晶法耦合了超滤膜分离和结晶两种过程，在结晶助剂存在的情况下， 使溶质的过饱和度维持在一个较高的水平，并使膜通量能维持在一个较理想的水平，溶质 的过饱和度得以逐步提高，更有利于晶体的生长，并且提高了溶质在母液中的回收率，同 时也能对结晶助剂进行循环使用。目前尚未有循环超滤一盐析结晶分离精制卵清溶菌酶的 方法。
技术实现思路
本专利技术的目的在于针对现有技术的缺陷，提供一种循环超滤-盐析结晶分离精制卵清溶 菌酶的方法
本专利技术目的通过以下技术方案实现一种循环超滤一盐析结晶分离精制卵清溶菌酶的方法，包括以下步骤(1) 卵清的预处理，获得卵清溶菌酶原料液用磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液将卵清稀释6-12倍，使用高压均质机在18-28MPa下 均质后，使用0.22 u m或0.45 U m微滤膜过滤除去固体杂质，然后用截留分子量为20-40kD 的超滤膜过滤，滤出液即为卵清溶菌酶原料液；(2) 卵清溶菌酶原料液的分离和浓縮在20-50°C、操作压力为0.10-0.45MPa下在切向流超滤装置中不断循环超滤卵清溶菌 酶原料液，至卵清溶菌酶原料液的溶菌酶含量为1-4% (w/v);(3) 超滤和盐析结晶集成进一步浓縮卵清溶菌酶原料液然后在卵清溶菌酶原料液中添加NaCl至NaCl浓度为1-4% (w/v)，在切向流超滤装置中， 在20-50'C、操作压力0.10-0.45MPa下继续超滤浓縮至卵清溶菌酶原料液中溶菌酶含量为 3-6% (w/v);(4)卵清溶菌酶在结晶罐中盐析结晶将切向流超滤装置的截留液排入结晶罐，添加NaCl至NaCl在卵清溶菌酶原料液中的 浓度为3-6% (w/v)，结晶温度为25-35'C，搅拌，使溶菌酶在结晶罐中成核并养晶至晶体 不再长大，离心分离晶浆中的晶体，真空干燥，即可得到本专利技术的溶菌酶晶体。步骤(1)所述的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液的pH为5.0-8.0,浓度为0.1-0.3mol/L浓度，以磷酸根计。步骤(2)所述的切向流超滤装置使用截留分子量为3-10kD的超滤膜过滤卵清溶菌酶 原料液。步骤(4)所述的搅拌的速度为100-300r/min。本专利技术方法将超滤技术与盐析结晶技术有机结合用于卵清溶菌酶的分离精制过程，通 过滤膜的选择性透过和不断循环作用将溶质与杂质分离，并不断浓縮至饱和，在结晶助剂 的作用下盐析结晶。本专利技术与现有技术相比，具有如下的优点和有益效果(1) 本专利技术较好地综合利用了盐析结晶法和超滤法各自的优点。盐析结晶法的优点是 能耗低，可以提高溶质从母液中的回收率，可在低温下进行，有效地保持卵清溶菌酶的活 性；而超滤同样可以在较低的温度下通过超滤膜的截留实现对溶质的浓縮及纯化，且操作方便。(2) 本专利技术克服卵清溶菌酶盐析结晶和超滤膜分离各自的技术缺陷。盐析结晶的缺陷 是结晶助剂耗用量大，晶体粒度小，杂质含量较高，难以达到纯度及晶形要求；而超滤技 术仍无法克服运行过程中的浓差极化现象，随着处理液浓度、粘度的提高，通量的衰减较 为明显，而且，浓縮后还得有能耗较大或影响活性的后续干燥过程。基于盐析结晶和超滤 两种过程的集成，在聚合物膜表面促进蛋白质非均相成核的情况下，减少结晶助剂加入量， 循环超滤使得溶质的过饱和度得以逐步提高，更有利晶体的生长，并进一步提高溶质从母 液中的回收率。G)本专利技术所述循环超滤一盐析结晶分离精制卵清溶菌酶的方法縮短了溶菌酶的生产 流程，保留了溶菌酶活性，提高了生产效率，并减少了废液的排放量。(4)采用本专利技术的方法，所获得的溶菌酶晶体粒径大于0.1mm，粒度均匀、形貌完整， 具有典型的晶体X射线衍射峰；比活力可达20,000U/mg以上，酶回收率可达70%以上， 纯化因子达25以上。 附图说明图1是本专利技术的循环超滤一盐析结晶分离精制卵清溶菌酶的工艺流程图； 图2是本专利技术实施例所获卵清溶菌酶晶体的X射线衍射图谱； 图3是本专利技术实施例所获卵清溶菌酶晶体的光学显微照片；图4是本专利技术实施例所获卵清溶菌酶晶体的扫描电子显微照片；图1中膜组件1中超滤膜的截留分子量为20-40kD，膜组件2中超滤膜的截留分子量 为3-10kD。 具体实施例方式以下结合实施例及附图l对本专利技术做进一步说明，但本专利技术的实施方式不限于此。 实施例1根据图1所示工艺流程，利用循环超滤一盐析结晶分离精制卵清溶菌酶的步骤如下(1) 用？11=5.0,浓度(以磷酸根计)为0.2mol/L的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液将 卵清稀释6倍，在28MPa下均质后，过0.22um微滤膜后用截留分子量为40kD的超滤膜 过滤，取滤出液；(2) 用截留分子量为3kD的超滤膜包，在20。C、操作压力0.45MPa下在切向流超滤 装置不断循环超滤卵清溶菌酶原料液至溶菌酶含量为4% (w/v);(3) 在卵清溶菌酶溶液中添加NaCl至其浓度为1% (w/v),用截留分子量为3kD的 超滤膜包，在2CTC、操作压力0.45MPa下继续超滤浓縮至溶液中的溶菌酶为6% (w/v); 在此条件下平均膜通量为0.25mL/(cm2min);(4) 将切向流超滤装置中的截留液排入结晶罐，添加NaCl至其在卵清溶菌酶溶液中 的浓度为3。/。(w/v)，结晶温度为35"C，搅拌速度为100r/min，使溶菌酶在结晶罐中成核 并养晶至晶体不再长大，离心分离晶浆中的晶体，真空干燥，即可得到平均晶体粒径为 O.lmm的溶菌酶晶体，所获得溶菌酶晶体的X射线衍射图谱如图2所示，具有典型的晶 体X射线衍射峰。实施例2根据图l所示工艺流程，利用循环超滤一盐析结晶分离精制卵清溶菌酶的步骤如下(1) 用pH-7.0,浓度(以磷酸根计)为O.lmol/L的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液将 卵清稀释12倍，在18MPa下均质后，过0.45um微滤膜后用截留分子量为30kD的超滤 膜过滤，取滤过液；(2) 用截留分子量为5kD的超滤膜包，在30°C、操作压力O.lOMPa下在切向流超滤 装置本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种循环超滤－盐析结晶分离精制卵清溶菌酶的方法，其特征在于包括以下步骤：　（１）卵清的预处理，获得卵清溶菌酶原料液　用磷酸氢二钠－磷酸二氢钠缓冲液将卵清稀释６－１２倍，使用高压均质机在１８－２８ＭＰａ下均质后，使用０．２２μｍ或 ０．４５μｍ微滤膜过滤除去固体杂质，然后用截留分子量为２０－４０ｋＤ的超滤膜过滤，滤出液即为卵清溶菌酶原料液；　（２）卵清溶菌酶原料液的分离和浓缩　在２０－５０℃、操作压力为０．１０－０．４５ＭＰａ下在切向流超滤装置中不断循环超 滤卵清溶菌酶原料液，至卵清溶菌酶原料液的溶菌酶含量为１－４％（ｗ／ｖ）；　（３）超滤和盐析结晶集成进一步浓缩卵清溶菌酶原料液　然后在卵清溶菌酶原料液中添加ＮａＣｌ至ＮａＣｌ浓度为１－４％（ｗ／ｖ），在切向流超滤装置中，在２０－５ ０℃、操作压力０．１０－０．４５ＭＰａ下继续超滤浓缩至卵清溶菌酶原料液中溶菌酶含量为３－６％（ｗ／ｖ）；　（４）卵清溶菌酶在结晶罐中盐析结晶　将切向流超滤装置的截留液排入结晶罐，添加ＮａＣｌ至ＮａＣｌ在卵清溶菌酶原料液中的浓度为 ３－６％（ｗ／ｖ），结晶温度为２５－３５℃，搅拌，使溶菌酶在结晶罐中成核并养晶至晶体不再长大，离心分离晶浆中的晶体，真空干燥，即可得到本专利技术的溶菌酶晶体。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：胡松青，李琳，桂林，陈玲，张喜梅，李晓玺，李冰，
申请(专利权)人：华南理工大学，
类型：发明
国别省市：81[中国|广州]