本发明专利技术公开了一种从鹅血中分离免疫球蛋白ＩｇＹ（ΔＦｃ）的方法。具体步骤如下：１）制备脱脂血浆，取新鲜血液，离心，除去红细胞，进行脱脂，得脱脂血浆。２）辛酸沉淀，向血浆中加入辛酸达到一定浓度，沉淀去除杂蛋白，离心分离，取上清液。３）柱层析，用填充有混合模式吸附剂的层析柱分离上清液，收集洗脱峰。４）脱盐和干燥，将收集液脱盐，冷冻干燥，得到纯度大于９５％的免疫球蛋白ＩｇＹ（ΔＦｃ）。本发明专利技术所开发方法的特色在于设计了一条新的分离工艺，可以从鹅血中分离免疫球蛋白ＩｇＹ（ΔＦｃ），方法的关键在于从辛酸沉淀的上清液中直接提取免疫球蛋白ＩｇＹ（ΔＦｃ），具有操作步骤简单，分离纯化因子高的优点，可以推广应用于其它水禽血液的处理。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物活性物质的分离纯化方法，尤其涉及一种从鹅血中分离免疫球蛋 白IgY(AFc)的方法。
技术介绍
我国是鸭鹅等水禽饲养的主要国家，年饲养总量达到43亿只，占世界总量的75% 以上。水禽血液是食品加工过程的下脚料，部分加工成熟血块食用，大部分被当废料直接排 到自然界中，不仅浪费了宝贵的生物资源，而且对环境造成了一定的污染。动物血液是重要 的蛋白质和矿物质来源，目前我国已部分利用了猪血、牛血等畜血资源制备血粉、提取蛋白 及其他生物活性成分，而水禽血液尚未得到充分利用。鹅血是一种高蛋白资源，蛋白含量高 达19%，含有大量球蛋白，具有增强机体免疫力、抗癌等多种功能，已经越来越引起人们的 关注。鹅血中免疫球蛋白包括IgM、IgA和υ -链免疫球蛋白。υ -链免疫球蛋白在鹅体 液中以IgY和IgY(AFc)两种形式存在，是鹅抗感染免疫的最主要抗体。IgY的分子量为 180kDa,由两条重链(67kDa)和两条轻链(23kDa)组成，重链包括一个可变区和四个恒定区 (CHl 4)，没有铰链区。IgY(AFc)的分子量为130kDa，也由两条重链和两条轻链组成，轻 链与IgY相同，但重链分子量仅37 42kDa，与IgY重链相比缺失了两个末端恒定区(CH3 和CH4)。由于IgY(AFc)分子结构的特殊性，免疫原性较低，具有很高的开发利用价值。经 文献检索发现，邱翔等(西南民族大学学报，2004，30 (3) 331-333)采用辛酸-硫酸铵沉淀 法、硫酸铵沉淀和DEAE纤维素层析法从鸭血浆中提取IgY，并进行了比较，发现辛酸_硫酸 铵法简便、快速，所获得的IgY纯度较高，但未报道具体数值。卜春文(食品科技，2004，(5) 79-81,85)从鹅血中提取IgY，收率达85%以上。以上两篇文献均未有效分离IgY( Δ Fe)。 日本专利(专利号JP2002030100A，公开日2002. 1.29)采用免疫亲和法从家禽的卵黄中提 取IgY ( Δ Fe)。因此，关于从鹅血等水禽血液中分离纯化得到高纯度的IgY (AFc),未见有 文献报道。鹅血中脂肪含量高，通过降低温度和静置，去除分层的脂肪，并结合二氧化硅吸 附，可以有效去除血液中的脂肪。辛酸沉淀法是免疫球蛋白蛋白质分离的有效方法，且辛 酸用量少，去除容易。混合模式吸附层析是近年来发展起来的新型层析技术，其功能配基 同时兼有疏水基团和离子交换基团，配基密度通常比较高，吸附容量大，可以通过静电相吸 来强化吸附或静电排斥来协助解吸，特别适合于大规模的分离纯化。本专利技术将混合模式吸 附层析与辛酸沉淀两种分离方法有效结合，用混合模式吸附剂直接处理辛酸沉淀的上清 液，充分利用混合模式吸附的高吸附容量、高抗体选择性的特性，建立起一种从鹅血中分离 IgY ( δ Fe)免疫球蛋的经济高效方法，可以推广应用到其它水禽血液的处理。
技术实现思路
本专利技术的目的是克服现有技术的不足，提供一种从鹅血中分离免疫球蛋白3IgY(AFc)的方法。从鹅血中分离免疫球蛋白IgY(AFc)的方法包括如下步骤1)配置0. IM的柠檬酸钠溶液作为抗凝剂，将新鲜鹅血与抗凝剂按照体积比为 9 1的比例混合均勻，用离心机以2500 3000rpm转速离心10 20分钟，得到血浆，4 8°C静置5 12小时，吸除上层聚集的脂肪，加入二氧化硅粉末进一步脱脂，二氧化硅粉末 的加入量为300 1000mg/ml血浆，室温搅拌30 60分钟，过滤，得到脱脂血浆；2)将脱脂血浆与浓度为60mM的乙酸-乙酸钠缓冲液(pH4 5)按照体积比为1 4混合均勻，得到稀释血浆，加入辛酸，辛酸加入量为30 100μ 1/ml稀释血浆，4 8°C静 置2 4小时，用离心机以8000-10000rpm转速离心20 30分钟，取上清液，得到免疫球 蛋白IgY(AFc)粗品溶液；3)调节免疫球蛋白IgY(AFc)粗品溶液的pH至5 7，用0. 45 μ m滤膜过滤后， 上样到填充有混合模式吸附剂的层析柱中，平衡缓冲液冲洗，洗脱缓冲液洗脱，收集洗脱峰 对应的洗脱缓冲液，得到免疫球蛋白IgY(AFc)溶液；4)将免疫球蛋白IgY(AFc)溶液脱盐，冷冻干燥，得到纯度> 95%的免疫球蛋白 IgY(AFc)固体产品。所述的混合模式吸附剂为MEP Hypercel，或者以4_巯乙基吡啶或2_巯甲基咪唑 为功能配基的层析介质。所述的平衡缓冲液为磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液，PH值为 5 7。所述的洗脱缓冲液为柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，pH值为3 4. 5。本专利技术针对鹅血等水禽血液资源的综合开发，通过辛酸沉淀与混合模式吸附层析 的有机结合，用于鹅血中免疫球蛋白IgY(AFc)的分离纯化。采用混合模式吸附剂直接处 理辛酸沉淀后的上清液，充分利用混合模式吸附的高吸附容量和高抗体选择性，提高分离 效率，简化分离步骤，得到一个经济高效的提取免疫球蛋白IgY(AFc)的方法。本专利技术的优 点在于1)快速，成本低廉；2)工艺简单，易于放大；3)过程处理量大，分离效率高；4)免疫 球蛋白IgY(AFc)的纯度高。附图说明附图是本专利技术混合模式吸附层析分离鹅血浆免疫球蛋白的电泳谱图。 具体实施例方式本专利技术提供一种从鹅血中分离免疫球蛋白IgY(AFc)的方法。将新鲜抗凝血液离 心去除红细胞，经过脱脂处理，得到脱脂血浆；用辛酸法沉淀去除部分杂蛋白，得到上清液； 将上清液通过混合模式吸附层析柱进行分离，得到免疫球蛋白IgY(AFc)。通过本专利技术分离 得到的免疫球蛋白IgY(AFc)纯度大于95%。从鹅血中分离免疫球蛋白IgY(AFc)的方法 包括如下步骤1)配置0. IM的柠檬酸钠溶液作为抗凝剂，将新鲜鹅血与抗凝剂按照体积比为 9 1的比例混合均勻，用离心机以2500 3000rpm转速离心10 20分钟，得到血浆，4 8°C静置5 12小时，吸除上层聚集的脂肪，加入二氧化硅粉末进一步脱脂，二氧化硅粉末 的加入量为300 1000mg/ml血浆，室温搅拌30 60分钟，过滤，得到脱脂血浆；2)将脱脂血浆与浓度为60mM的乙酸-乙酸钠缓冲液(pH4 5)按照体积比为1 4混合均勻，得到稀释血浆，加入辛酸，辛酸加入量为30 100μ 1/ml稀释血浆，4 8°C静 置2 4小时，用离心机以8000-10000rpm转速离心20 30分钟，取上清液，得到免疫球 蛋白IgY(AFc)粗品溶液；3)调节免疫球蛋白IgY(AFc)粗品溶液的pH至5 7，用0. 45 μ m滤膜过滤后， 上样到填充有混合模式吸附剂的层析柱中，平衡缓冲液冲洗，洗脱缓冲液洗脱，收集洗脱峰 对应的洗脱缓冲液，得到免疫球蛋白IgY(AFc)溶液；4)将免疫球蛋白IgY(AFc)溶液脱盐，冷冻干燥，得到纯度> 95%的免疫球蛋白 IgY(AFc)固体产品。所述的混合模式吸附剂为MEP Hypercel，或者以4_巯乙基吡啶或2_巯甲基咪唑 为功能配基的层析介质。所述的平衡缓冲液为磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液，PH值为 5 7。所述的洗脱缓冲液为柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，pH值为3 4. 5。以下通过实施例对本专利技术作进一步的描述实施例1取新鲜鹅血，按照9 1(体积比)的比例加入0本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种从鹅血中分离免疫球蛋白ＩｇＹ（ΔＦｃ）的方法，其特征在于包括如下步骤： １）配置０．１Ｍ的柠檬酸钠溶液作为抗凝剂，将新鲜鹅血与抗凝剂按照体积比为９∶１的比例混合均匀，用离心机以２５００～３０００ｒｐｍ转速离心１０～２０分钟，得到血浆，４～８℃静置５～１２小时，吸除上层聚集的脂肪，加入二氧化硅粉末进一步脱脂，二氧化硅粉末的加入量为３００～１０００ｍｇ／ｍｌ血浆，室温搅拌３０～６０分钟，过滤，得到脱脂血浆； ２）将脱脂血浆与浓度为６０ｍＭ的乙酸－乙酸钠缓冲液（ｐＨ４～５）按照体积比为１～４混合均匀，得到稀释血浆，加入辛酸，辛酸加入量为３０～１００μｌ／ｍｌ稀释血浆，４～８℃静置２～４小时，用离心机以８０００－１００００ｒｐｍ转速离心２０～３０分钟，取上清液，得到免疫球蛋白ＩｇＹ（ΔＦｃ）粗品溶液； ３）调节免疫球蛋白ＩｇＹ（ΔＦｃ）粗品溶液的ｐＨ至５～７，用０．４５μｍ滤膜过滤后，上样到填充有混合模式吸附剂的层析柱中，平衡缓冲液冲洗，洗脱缓冲液洗脱，收集洗脱峰对应的洗脱缓冲液，得到免疫球蛋白ＩｇＹ（ΔＦｃ）溶液； ４）将免疫球蛋白ＩｇＹ（ΔＦｃ）溶液脱盐，冷冻干燥，得到纯度＞９５％的免疫球蛋白ＩｇＹ（ΔＦｃ）固体产品。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：林东强，童红飞，姚善泾，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：86
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