一种昆虫幼虫石蜡切片方法技术

本发明专利技术公开了一种昆虫幼虫石蜡切片方法，属于显微组织切片技术领域。该方法包括组织固定、组织脱水、组织透明、浸蜡、包埋与切片、展片与粘片、脱蜡和组织复水等步骤，操作简单、耗时短，最终切片对组织区分度高，能观察到虫体完整的空间结构，适用于身体柔软、液体含量高、腔室比例大的幼虫虫体材料。采用该方法处理3龄棉铃虫幼虫虫体，在明场下观察其体壁完整，体腔内部的肌肉组织、神经组织等分布其间，占身体比例大的消化道结构清晰完整，一对腹足的空间结构正常；在蓝光激发下，能够观察到各器官组织被激发的自发绿色荧光水平。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术公开了，属于显微组织切片
。该方法包括组织固定、组织脱水、组织透明、浸蜡、包埋与切片、展片与粘片、脱蜡和组织复水等步骤，操作简单、耗时短，最终切片对组织区分度高，能观察到虫体完整的空间结构，适用于身体柔软、液体含量高、腔室比例大的幼虫虫体材料。采用该方法处理3龄棉铃虫幼虫虫体，在明场下观察其体壁完整，体腔内部的肌肉组织、神经组织等分布其间，占身体比例大的消化道结构清晰完整，一对腹足的空间结构正常；在蓝光激发下，能够观察到各器官组织被激发的自发绿色荧光水平。【专利说明】
本专利技术具体涉及，属于显微组织切片
。
技术介绍
昆虫石蜡切片技术是研究昆虫组织形态及组织病理的重要实验技术，一般包括解剖、固定、脱水透明、包埋、切片等步骤。昆虫外骨骼较为坚硬，难以制作完整的石蜡切片，目前昆虫石蜡切片方法多数用于昆虫的局部组织或器官(如触角、消化道、足等)，这样不能观察到昆虫整体的显微结构。昆虫幼虫柔韧的体壁包裹着开放流动的血淋巴和体液,血淋巴和体液中从头部至尾部贯穿着管状消化道，消化道相对体积较大，消化道内由昆虫摄取的食物填充，食物水分含量高。针对这种身体柔软、液体含量高、腔室比例大的幼虫虫体材料，目前常规的切片方法不仅操作复杂，需要耗费较长时间，且常使用毒性大的二甲苯等化学物质，更重要的是最终固定、包埋、切片等的效果不够理想，最终切片对组织区分度十分有限，尤其是占虫体比例非常大的消化道容易变形或破碎，难以观察到虫体完整空间结构。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供。为了实现以上目的，本专利技术所采用的技术方案是:，包括以下步骤:(I)组织固定:取昆虫虫体浸于组织固定液中，抽真空并保持负压10?30分钟(使虫体完全沉至底部)，再于4°C下静置10?14小时；(2)组织脱水:取组织固定后的虫体，4°C条件下，依次用浓度梯度为50%、60%、70%、90%、100%的乙醇溶液脱水，每个梯度的处理时间至少为I小时；(3)组织透明:取组织脱水后的虫体，室温下在组织透明剂中浸泡5?9小时(每1.5?2小时更换组织透明剂一次);(4)浸蜡、包埋与切片:取组织透明后的虫体，在65°C的液体石蜡中浸泡7?9小时，凝固定型后切片；(5)展片与粘片:取切片移至载玻片上，在切片边缘滴加60°C的蒸馏水至切片完全展开，再置于30?37°C条件下10?14小时粘片；(6)脱蜡和组织复水:取组织透明剂滴加在切片组织上，保持至少20分钟后吸走，重复至少按此，再依次滴加浓度梯度为100%、95%、85%、70%、50%、30%的乙醇溶液和水，每个梯度的处理时间为I?5分钟。所述步骤(I)中的组织固定液为:取IOOmL PBS缓冲液，调节缓冲液pH值至10.5?11.5，加热至65?75°C，加入多聚甲醛至终浓度为4%，待溶解完全后冷却，调节溶液pH值至6.5?7.5，再加入30 μ L吐温-20或吐温Χ-100，冷却至4°C备用。固定液的用量与虫体的体积比为20:1。所述的PBS 缓冲液的组成为:NaCl 137mmol/L, KCl 2.7mmol/L, Na2HPO4 IOmmol/L, KH2PO4 2mmol/L, pH 值为 5 ?7。所述步骤(I)中负压的压力值为-1.0KPa0所述步骤(2)中乙醇用量与虫体的体积比为20:1 ;每个梯度的处理时间优选为I小时。所述步骤(2 )中组织脱水步骤为:I) 4°C条件下，50%乙醇中保持Ih,2) 4°C条件下，60%乙醇中保持Ih,3) 4°C条件下，70%乙醇中保持Ih (此步骤可长期存放)，4) 4°C条件下，90%乙醇中保持Ih,5)4°C条件下，无水乙醇中保持lh，6)4°C条件下，无水乙醇中保持lh，7)4°C条件下，无水乙醇中保持lh。所述步骤(3 )中组织透明步骤为:I)室温条件下，组织透明剂中浸泡I.5?3小时，2 )室温条件下，组织透明剂中浸泡1.5?3小时，3 )室温条件下，组织透明剂中浸泡2?3小时。所述步骤I)、2 )中的浸泡时间优选1.5小时，步骤3 )中的浸泡时间优选2小时。所述的组织透明剂为Histo-Clear，型号为SG HS-200，购自美国NationalDiagnotics 公司。所述步骤(4)中浸蜡步骤为:I)浸入液体石蜡，65°C浸泡2小时，2)浸入液体石蜡，65°C浸泡2小时，3)浸入液体石蜡，65°C浸泡2小时，4)浸入液体石腊，65°C浸泡2小时。所述步骤(4)中将第四次的石蜡连同虫体组织一起倒入包埋盒中，迅速调整虫体在石蜡中的位置，在冷水中凝固定型完成包埋。所述步骤(6)中脱蜡和组织复水步骤为:I)将组织透明剂滴加在切片组织上，保持20min，再用吸水纸在切片边缘吸走，2)将组织透明剂滴加在切片组织上，保持20min，再用吸水纸在切片边缘吸走，3)将组织透明剂滴加在切片组织上，保持20min，再用吸水纸在切片边缘吸走，4)将无水乙醇滴加在切片组织上,保持Imin,再用吸水纸在切片边缘吸走，5)将无水乙醇滴加在切片组织上,保持Imin,再用吸水纸在切片边缘吸走，6)将95%乙醇滴加在切片组织上，保持lmin，再用吸水纸在切片边缘吸走，7)将85%乙醇滴加在切片组织上，保持lmin，再用吸水纸在切片边缘吸走，8)将70%乙醇滴加在切片组织上，保持lmin，再用吸水纸在切片边缘吸走，9)将50%乙醇滴加在切片组织上，保持lmin，再用吸水纸在切片边缘吸走，10)将30%乙醇滴加在切片组织上，保持lmin，再用吸水纸在切片边缘吸走，11)将无菌水滴加在切片组织上，保持lmin，再用吸水纸在切片边缘吸走。本专利技术的有益效果:本专利技术中昆虫幼虫石蜡切片方法，操作简单、耗时短，最终切片对组织区分度高，能观察到虫体完整的空间结构,适用于身体柔软、液体含量高、腔室比例大的的幼虫虫体材料。采用该方法处理3龄棉铃虫幼虫虫体，在明场下观察其体壁完整，体腔内部的肌肉组织、神经组织等分布其间，尤其是占身体比例非常大的消化道结构清晰完整，甚至一对腹足也空间结构正常；在蓝光激发下，能够观察到各器官组织被激发的自发绿色荧光水平。本专利技术昆虫整体石蜡切片方法即可以弥补局部观察的不足，还可以进行免疫酶染色和原位杂交等组织定位，为昆虫生理、病理学等方面的研究提供新的试验方法。本专利技术在组织透明步骤中采用Histo-Clear组织透明剂，在处理组织切片时不需要吸入有毒的二甲苯，安全性高，透明处理效果好。Histo-Clear处理的样本没有二甲苯处理的硬和脆，方便切成更薄的切片，并且延长了切片刀片的寿命。【专利附图】【附图说明】图1为本专利技术实施例1中棉铃虫3龄幼虫虫体腹节横切面切片。【具体实施方式】下述实施例仅对本专利技术作进一步详细说明，但不构成对本专利技术的任何限制。实施例1本实施例中昆虫幼虫石蜡切片方法，包括以下步骤:1、组织固定在化学通风柜中配制4%的多聚甲醛溶液作为组织固定液，固定液现配现用，组织固定液配制流程为:在100毫升PBS缓冲液(PBS缓冲液:NaCl 137mmol/L, KCl 2.7mmol/L,Na2HPO4 IOmmoI/L，KH2PO4 2mmol/L，pH值为5?7)中，添加固体氢氧化钠颗粒，使pH值达到11，然后本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：李永丽，周洲，源春彦，李红英，刘圣明，
申请(专利权)人：河南科技大学，
类型：发明
国别省市：