气相色谱-质谱检测细胞内中糖、有机酸的方法技术

本发明专利技术涉及一种气相色谱-质谱检测细胞内糖、有机酸的方法，属于生物化学检验测定技术领域。本发明专利技术检测方法步骤包括：（1）取发酵液，高速离心，分别收集细胞和细胞外液；（2）细胞内代谢物样品制备，将收集的菌体用生理盐水清洗，冷甲醇溶解后超声破碎，低温萃取，离心收集萃取上清液，加入内标物，低温真空烘干；（3）样品衍生，加入糖衍生剂、氨基酸衍生剂；（4）气相色谱-质谱分析和数据采集。本发明专利技术具有样品处理简单，操作简便，检测糖、有机酸时间短，灵敏度高，检测结果重复性高，可实现多个样品制备等优点。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术涉及一种气相色谱-质谱检测细胞内糖、有机酸的方法，属于生物化学检验测定
。本专利技术检测方法步骤包括：（1）取发酵液，高速离心，分别收集细胞和细胞外液；（2）细胞内代谢物样品制备，将收集的菌体用生理盐水清洗，冷甲醇溶解后超声破碎，低温萃取，离心收集萃取上清液，加入内标物，低温真空烘干；（3）样品衍生，加入糖衍生剂、氨基酸衍生剂；（4）气相色谱-质谱分析和数据采集。本专利技术具有样品处理简单，操作简便，检测糖、有机酸时间短，灵敏度高，检测结果重复性高，可实现多个样品制备等优点。【专利说明】
本专利技术属于生物化学检验测定
，特别是涉及一种。
技术介绍
在利用气相色谱-质谱检测糖代谢物方面，目前已有相关技术报道，如专利201210046953.2，公布了一种气相色谱一质谱检测尿糖的方法，包括如下步骤:(I)对待检尿液样本完成尿酶处理；(2)加入内标品，采用冷冻乙醇进行沉淀蛋白的处理，将样本吹干；(3)对上述样本进行甲基硅烷化衍生处理；(4)采用上述1-3的步骤处理标准糖，得到标准糖样本；(5)采用气相色谱一质谱联用仪对标准糖样本和待检尿液样本进行检测；(6)以标准糖样本的检测结果作为参比曲线，用常规算法对待检尿液样本的糖进行定量。该专利专利技术主要应用领域为尿样检测，且该检测方法仅局限于糖代谢物的检测。对于微生物胞内、胞外代谢物的检测研究，可以揭示微生物在发酵条件下的代谢规律，尤其是发酵条件对于微生物目标产物的影响规律。掌握微生物的代谢规律可以不仅有利的促进目标产物的产量提升，而且可确定菌体内的代谢通量分布，进而利用基因工程手段实现菌体内代谢途径的优化与重构，实现目标产物高效生物合成。目前对于细胞内的代谢物分析检测方法局限用于特定某类物质，不可实现多类代谢物同时检测。由于细胞内各成分含量复杂多样，对于样品的处理方法很关键，目前还没有相关细胞内、细胞外代谢物的系统处理检测方法，使得开发一种更为灵敏的、广谱的、通用的发酵代谢物检测方法，鉴定各种谱峰对映的化合物结构，以及与其它虚拟模型的整合，成为微生物代谢组研究的热点。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种气相色谱-质谱检测细胞内糖、有机酸的方法，弥补目前在微生物发酵中对代谢物系统检测方法的空白，克服现有检测技术干扰因素很多、操作繁琐、测试成本高、灵敏度低、检测范围窄等缺点。本专利技术的方案是通过这样实现的:一种气相色谱-质谱检测细胞内糖、有机酸的方法，检测方法步骤包括: (1)取发酵液，高速离心，分别收集菌体和上清液I; (2)细胞内代谢物样品制备:取步骤I)得到的菌体，用生理盐水清洗2?3次，冷甲醇溶解后超声破碎至细胞裂解，得到裂解液，低温萃取裂解液，离心收集5(T200ul萃取后裂解上清液II，加入内标物核糖醇溶液，裂解上清液II体积与内标物核糖醇重量比例为5(T200ul: 20 μ g，室温真空烘干，得到细胞内代谢物样品I ; (3)样品衍生:在步骤2)得到的样品I中，分别加入5(Tl50ul糖衍生剂，恒温放置1.5?4h，再分别加入5(Tl50ul糖衍生剂，恒温放置过夜，衍生完毕，离心衍生后的样品I，收集上清得到待测胞内样品I;(4)利用气相色谱-质谱对步骤3)得到的待测胞内样品I，进行分析和数据采集。作为本专利技术的进一步限定，所述菌体其取样量为用冷甲醇溶解后生物量干重达0.2^1.0g/ml ;所述的冷甲醇为经过冷浴槽预冷至-40°C;所述低温萃取为_40°C至_50°C下萃取2~7h。作为本专利技术的进一步改进，所述糖衍生剂为0.r0.3mg甲氧胺盐酸溶于IOml吡啶溶液中配制而得；所述氨基酸衍生剂为5(T200ul三甲基氯硅烷溶于IOml的三氟乙酰胺中。作为本专利技术的进一步改进，所述气相色谱-质谱其仪器分析条件为:气相色谱:色谱柱为30 mX0.25 mm的HP-5MS或者DB-5MS毛细管柱，进样口温度300°C，检测器温度250°C，柱箱升温程序平衡时间3 min — 80°C维持Imin — 2V /min升温至100°C— 15°C /min升温至220°C— 30°C /min升温至300°C— 300°C维持3 min,进样体积I y L ;质谱:离子源EI，检测器为四级杆，电离能70 eV，离子源表面温度280°C。作为本专利技术的进一步改进，该方法应用于检测酵母菌、乳酸菌、梭菌、霉菌的生物发酵过程中的细胞内的糖、有机酸。作为本专利技术的进一步改进，其特征在于，所述糖为葡萄糖、果糖、木糖；所述有机酸为琥珀酸、苹果酸、柠檬酸、丙酮酸、富马酸。本专利技术的实质性特点和显著进步是:(1)该方法可以检测细胞内细胞内中糖类物质的检测，不需要对发酵液进行多次复杂处理，节约时间和简化操作步骤，及时得到发酵过程中微生物代谢规律，分析胞内代谢流量。(2)该方法采用冷甲醇萃取细胞内代谢物法，其萃取效果优良，获得细胞内较多代谢物种类，有利于代谢规律的分析。(3)样品分析得到的色谱峰分析效果良好，可对葡萄糖、果糖、木糖等糖实现检测；可对琥珀酸、苹果酸、柠檬酸、丙酮酸、富马酸等有机酸实现检测。【具体实施方式】`下面将通过实施例对本专利技术方法进一步的描述，这些描述并不是对本
技术实现思路
作进一步的限定。以下实施例中离心条件为:_4°C下10000 rpm离心10 min。以下实施例中气相色谱-质谱其仪器分析条件为:气相色谱:色谱柱为30mX0.25 mm的HP-5MS或者DB-5MS毛细管柱，进样口温度300°C，检测器温度250°C，柱箱升温程序平衡时间3 min — 80°C维持Imin — 2V /min升温至100°C— 15°C /min升温至2200C- 30°C /min升温至300°C— 300°C维持3 min，进样体积I y L ;质谱:离子源EI，检测器为四级杆，电离能70 eV，离子源表面温度280°C。以下实施例皆可实现对葡萄糖、果糖、木糖等糖进行检测；可对琥珀酸、苹果酸、柠檬酸、丙酮酸、富马酸等有机酸实现检测。实施例1 取酵母菌发酵培养液。(I)细胞内代谢物样品制备:取5ml发酵液，离心得到菌体，用生理盐水清洗菌体2次，-40°C冷甲醇溶解后生物量干重达0.2g/ml，超声破碎至细胞裂解，得到裂解液，低温萃取裂解液，低温条件为:-40°C至-50°C下萃取4h，离心收集150ul萃取后裂解上清液I，加入内标物核糖醇溶液，裂解上清液I体积与内标物核糖醇重量比例为150ul:20ii g，室温真空烘干，得到细胞内代谢物样品I。(2)细胞外液样品制备:取发酵液，离心得到上清液II，取300ul上清液II，在清液II中加入乙腈除去蛋白，上清液II与乙腈体积比为1: 1.2，涡旋振荡，再离心收集得上清液III，加入内标物核糖醇溶液，上清液III体积与内标物核糖醇重量比例为IOOul:20yg，室温真空烘干，得到细胞外液样品II。(3)样品衍生:在步骤I)和步骤2)得到的样品I和样品II中，分别加入IOOul糖衍生剂(糖衍生剂为0.1mg甲氧胺盐酸溶于IOml吡啶溶液中配制而得)，恒温放置1.5h，再分别加入IOOul氨基酸衍生剂(氨基酸衍生剂为IOOul三甲基氯硅烷溶于IOml的三氟乙酰胺中配制而得)，恒温放置过本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种气相色谱‑质谱检测细胞内糖、有机酸的方法，其特征在于，检测方法步骤包括：（1）取发酵液，高速离心，分别收集菌体和上清液Ⅰ；（2）细胞内代谢物样品制备：取步骤1）得到的菌体，用生理盐水清洗2~3次，冷甲醇溶解后超声破碎至细胞裂解，得到裂解液，低温萃取裂解液，离心收集50~200ul萃取后裂解上清液Ⅱ，加入内标物核糖醇溶液，裂解上清液Ⅱ体积与内标物核糖醇重量比例为50~200ul:20μg，室温真空烘干，得到细胞内代谢物样品Ⅰ；（3）样品衍生：在步骤2）得到的样品Ⅰ中，分别加入50~150ul糖衍生剂，恒温放置1.5~4h，再分别加入50~150ul氨基酸衍生剂，恒温放置过夜，衍生完毕，离心衍生后的样品Ⅰ，收集上清得到待测胞内样品Ⅰ；（4）利用气相色谱‑质谱对步骤3）得到的待测胞内样品Ⅰ，进行分析和数据采集。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：陈东，梁远雄，
申请(专利权)人：柳州联海科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广西;45