一种中华鳖脂肪酸分析方法技术

本发明专利技术涉及水生生物、分析化学领域，具体说的是一种通过（气相色谱串联质谱）GC-MS结合保留指数分离鉴定中华鳖体内脂肪酸的组成的方法。分离中华鳖脂肪组织，并对其中脂肪酸提取、衍生制备成脂肪酸甲酯。其分离鉴定方法为：将中华鳖脂肪酸甲酯溶与正己烷中，用GC-MS分析，达到分离的目的，根据不同脂肪酸甲酯的保留时间计算其保留指数，质谱库搜库同时结合保留指数定性，面积归一化法计算各脂肪酸甲酯的相对含量，达到准确、快速分析中华鳖脂肪酸组成的目的。本发明专利技术的特点：充分利用质谱库搜库结合保留指数定性的方法，可准确的鉴定中华鳖体内脂肪酸的组成，尤其是操作简便，结果比质谱库搜库的方法更准确。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术涉及水生生物、分析化学领域，具体说的是一种通过（气相色谱串联质谱）GC-MS结合保留指数分离鉴定中华鳖体内脂肪酸的组成的方法。分离中华鳖脂肪组织，并对其中脂肪酸提取、衍生制备成脂肪酸甲酯。其分离鉴定方法为：将中华鳖脂肪酸甲酯溶与正己烷中，用GC-MS分析，达到分离的目的，根据不同脂肪酸甲酯的保留时间计算其保留指数，质谱库搜库同时结合保留指数定性，面积归一化法计算各脂肪酸甲酯的相对含量，达到准确、快速分析中华鳖脂肪酸组成的目的。本专利技术的特点：充分利用质谱库搜库结合保留指数定性的方法，可准确的鉴定中华鳖体内脂肪酸的组成，尤其是操作简便，结果比质谱库搜库的方法更准确。【专利说明】
:本分明属于分析化学领域，特别涉及采用气相色谱质谱结合保留指数法进行中华鳖脂肪酸分析的方法。
技术介绍
: 中华鳖隶属爬行纲、龟鳖目、鳖科、鳖属，广泛分布于我国除新疆、西藏，青海以外的其他省份，为我国名贵的水生爬行动物。中华鳖肉质细嫩、营养丰富、高蛋白，备受国内外消费者的青睐。中华鳖除了营养美味外，还具有较高的药用价值。据《名医别录》记载，鳖性味甘，平，有滋阴补肾，清退虚热的功效，鳖甲、鳖血更具有治疗阴虚以及补血的药用功效，为食疗佳品。中华鳖脂肪中富含EPA、DHA等不饱和脂肪酸，具有抗癌、促进生长发育、增强记忆力等功效，临床上已被用于治疗高血压、糖尿病等疾病。白晶等采用超临界C02萃取技术，利用低温浓缩工艺从中华鳖油中提取到DHA和EPA，得到中华鳖油中EPA+DHA的含量为26.39%0L1-Hsun Chang等用超临界C02法从中华鳖脂肪酸中提取不饱和脂肪酸，Chen-HueiHuang等发现中华鳖自身可以合成18个碳以下的脂肪酸，但是不能合成高不饱和度的脂肪酸，同时发现中华鳖体内不饱和脂肪酸占总脂肪酸的70%以上。通过分析中华鳖脂肪中脂肪酸的组成尤其是不饱和脂肪酸的组成，为中华鳖脂肪的合理利用提供依据。气相色谱质谱(GC-MS)结合质谱谱库检索方法是将组分的质谱峰与质谱数据库图谱进行匹配比对，以匹配度高的化合物作为鉴定结果，已被广泛应用于动植物脂肪酸的分析。由于脂肪酸种类较多，从结构上分类主要有直链脂肪酸、支链脂肪酸和复杂形势的脂肪酸三种类型，脂肪酸的链长、双键位置和数量以及取代基团不同均会导致分离的不准确，尤其是长链脂肪酸结构比较复杂经常会有同分异构体存在，以及受分离度和色谱条件变化等因素的影响，会使脂肪酸的质谱图检索结果出现偏差，使得难以准确定性，甚至出现错误。为提高鉴定的准确性，采用保留指数和质谱检索相结合的改良方法可显著越来越多地应用于定性定量分析中。采用液-液萃取法从中华鳖脂肪中提取脂肪酸并进行甲酯化衍生，然后通过气相色谱质谱(GC-MS)谱库检索结合保留指数，对中华鳖的脂肪酸进行定性定量分析，以鉴别中华鳖脂肪中的脂肪酸组成。
技术实现思路
: 本专利技术气相色谱质谱结合保留指数分析方法分析中华鳖脂肪，得到了其精确地脂肪酸总离子流色谱图、相应的质谱图和保留指数。通过比较脂肪酸甲酯的质谱谱库结构和相应的保留指数，可以对中华鳖脂肪酸进行定性分析。本专利技术的方法包括以下步骤:，包括以下步骤: (1)中华鳖宰杀后取脂肪组织10g，-18 °C保存； (2)称取甲鱼脂肪Ig，碾碎后放入10 mL玻璃试管中，加入10 mL提取液，混匀后密封浸提24 h;提取完成后，用不含脂肪的滤纸过滤，再加入5 mL提取液冲洗残渣，2次滤液合并保存；所述提取液为体积比为2:1的氯仿:甲醇； (3)取脂肪提取液5mL，加入3 mL 10% KOH甲醇溶液，混匀后，置于80 1:水浴反应Ih;室温冷却后，加入3 mL 14% BF3甲醇溶液(v/v)混匀后，于50 1:水浴反应10 min ;冷却后，加入3 mL正己烷，震荡涡旋，室温静置过夜；取上层正己烷层至进样小瓶，-18 °C冷冻，待GC-MS分析； (4)将进样瓶中的脂肪酸甲酯进行气相色谱质谱分析，色谱条件:色谱柱为安捷伦DB-5MS石英毛细管柱30.0 mX0.25 mmX0.25 μ m ;载气为高纯氦气；流速I mL/min ;程序升温:60 °C保持I min,以10 V /min升至160 °C并保持4 min,以5°C /min升至260 V并保持5min,以5 °C/min升至280 °C并保持I min ;分流比20:1 ;进样量I μ L ;质谱条件=EI离子源；电子能量70 eV ;离子源温度220 V ;进样口温度240°C，质量扫描范围:m/z 40~600 ;溶剂切除时间2.5 min。在进行气相色谱质谱分析之后，还包括对分析的脂肪酸甲酯计算保留指数进行计算的步骤: (1)将正构烷烃混合标准品(C8-C40)以脂肪酸甲酯分析的条件进行气相色谱质谱分析； (2)记录每个正构烷烃标准品的保留时间；采用保留指数的线性升温公式:i?/ = 100?+100^^计算各组分的RI值，其中^,、、和t(n+1)分别为被分析组分和碳原 in In子数处于η和η+1之间的正构烷烃混标标准品的流出峰保留时间(min)； (3)根据http://webbook.nist.gov/chemistry/搜索文献得相应色谱柱各脂肪酸甲酯的保留指数RI，结合质谱库检索，同时运用面积归一化法计算各脂肪酸的相对百分含量。本专利技术的方法不仅可以打破常规的气相色谱质谱定性的局限，减少因为质谱库不全或相似度接近对中华鳖脂肪酸分析带来的误差，同时为其他生物的脂肪酸分析鉴定提供方便、准确的定性方法，而且还能够应用该方法鉴定其他气相色谱质谱难以准确定性的物质。【专利附图】【附图说明】图1中华鳖脂肪酸甲酯总离子流图 【具体实施方式】: 以下提供本专利技术的【具体实施方式】。实施例1 采用本专利技术方法分析了鄱阳湖中华鳖脂肪酸的组成，随机抽取健康鄱阳湖中华鳖一只，体重约500g，宰杀后取其四肢周围脂肪组织冷冻备用。脂肪提取:称取中华鳖脂肪I g，碾碎后放入10 mL玻璃试管中，加入10 mL提取液(氯仿:甲醇=2:1，v/v)，混匀后密封浸提24 h。提取完成后，用不含脂肪的滤纸过滤，再加入5 mL提取液冲洗残渣，2次滤液合并保存。脂肪酸甲酯化:取上述脂肪提取液5 mL，加入3 mL 10% KOH甲醇溶液(v/v)，混匀后,置于80 °(:水浴反应I h。室温冷却后,加入3 mL 14% BF3甲醇溶液(v/v),混匀后，于50 1:水浴反应10 min。冷却后，加入3 mL正己烷，震荡涡旋，室温静置过夜。取上层正己烷层至进样小瓶，-18 °C冷冻，GC-MS分析。气相色谱质谱仪器条件如下:GC/MS为QP2010型，是岛津公司的产品 色谱条件:色谱柱为安捷伦DB-5MS石英毛细管柱(30.0 mX0.25 mmX0.25 μ m);载气为高纯氦气；流速I mL/min ;程序升温:60 °C保持I min,以10 V /min升至160。(!'并保持4 min,以5°C /min升至260 °C并保持5min,以5 °C /min升至280 °C并保持I min ；分流比20:1;进样量I yL。质谱条件:EI离子源；电子能量70 eV;离子源温度2本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种中华鳖脂肪酸分析方法，包括以下步骤：（1）中华鳖宰杀后取脂肪组织10 g， ‑18 ℃保存；（2）称取甲鱼脂肪1 g，碾碎后放入10 mL玻璃试管中，加入10 mL提取液，混匀后密封浸提24 h；提取完成后，用不含脂肪的滤纸过滤，再加入5 mL提取液冲洗残渣，2次滤液合并保存；所述提取液为体积比为2:1的氯仿：甲醇；（3）取脂肪提取液5 mL，加入3 mL 10% KOH甲醇溶液，混匀后，置于80 ℃水浴反应1 h；室温冷却后，加入3 mL 14% BF3甲醇溶液 (v/v)混匀后，于50 ℃水浴反应10 min；冷却后，加入3 mL正己烷，震荡涡旋，室温静置过夜；取上层正己烷层至进样小瓶，‑18 ℃冷冻，待GC‑MS分析；（4）将进样瓶中的脂肪酸甲酯进行气相色谱质谱分析，色谱条件：色谱柱为安捷伦DB‑5MS石英毛细管柱30.0 m×0.25 mm×0.25 μm；载气为高纯氦气；流速1 mL/min；程序升温：60 ℃保持1 min，以10 ℃/min 升至160 ℃并保持4 min，以5℃/min升至260 ℃并保持5min，以5 ℃/min升至280 ℃并保持1 min；分流比20:1；进样量1 μL；质谱条件：EI离子源；电子能量70 eV；离子源温度220 ℃；进样口温度240℃，质量扫描范围：m/z 40~600；溶剂切除时间2.5 min。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：焦丰龙，洪一江，魏远隆，王军花，盛军庆，王诚远，侯喜洋，
申请(专利权)人：南昌大学，
类型：发明
国别省市：江西;36