RNA和DNA双外参以及DNA内参实时定量荧光PCR检测方法技术

本发明专利技术公开了一种RNA和DNA双外参以及DNA内参实时定量荧光PCR检测方法，包括步骤：选定外参基因和内参基因；制备外参基因mRNA与DNA的预混合液；收集样品及预混合液的总mRNA和DNA；实时定量荧光PCR，检测外参基因和待测基因的mRNA和DNA拷贝数以及内参基因DNA拷贝数，从而同时得到基因的表观表达水平、DNA拷贝数相对量以及细胞水平相对表达量，为基因样本检测及机理研究提供了多层次信息。

【技术实现步骤摘要】
RNA和DNA双外参以及DNA内参实时定量荧光PCR检测方法
本专利技术涉及分子生物学及生物信息学领域，具体涉及一种RNA和DNA双外参以及DNA内参实时定量荧光PCR检测方法。
技术介绍
自从1970年克里克提出分子生物学的中心法则以来，人们对于基因的转录表达和及其调控的机制进行了大量的研究。Northern杂交方法是最早被用来测定基因转录量的方法。后来,结合逆转录和聚合酶链式反应产生的RT-PCR(reverse transcription-PCR,即:逆转录-聚合酶链式反应)提供了一种灵敏而又简便的半定量测定方法。近年来，实时定量聚合酶链式反应(简称为:qPCR)方法由于其灵敏、准确和重复性好，因此逐步成为基因表达的定量测定的主要方法。上述方法为了减少由于RNA不稳定和逆转录的效率问题产生的误差，通常将待测基因的转录水平表示为与一个参考值(内参基因mRNA水平、细胞内总RNA水平)的相对表达量。内参通常为看家基因，如:β -actin,GAPDH以及rRNA等。然而，由于不同组织来源、或同一组织在不同条件下，细胞的总RNA量和/或内参的量并不恒定，因此，基于该前提所进行的基因转录水平检测往往不准确。针对这一问题，我们曾经提出“RNA和DNA双外参实时定量荧光PCR检测方法”，检测基因在某个时刻、某个细胞状态下的mRNA和DNA的比值，确定该基因每个DNA拷贝的转录水平，并将其命名为表观表达水平 [1](专利号:ZL200910049306.5)。这一概念的提出和技术的实现使得任一基因的mRNA水平直接与基因拷贝数建立关联，由此，同一基因的表观表达水平在不同组织之间、同一组织不同条件之间、不同批次实验之间可以进行比较，不同基因的启动子之间也可以进行比较，能够为基因表达调控研究提供最本质的彳目息。然而，我们注意到，近年来拷贝数变异(copy number variations,CNVs)引起人们越来越多的关注。CNVs指长度超过Ik的片段在基因组上拷贝数的变化，涉及缺失或复制两类事件。CNVs在基因组中分布相当普遍，以人类基因组为例，CNV可能影响到约2%的基因组序列[2]。其中一部分CNVs通过改变基因表达量、生成截断的蛋白产物、影响调控序列等方式造成样本间表型的差异，包括疾病的发生。由于CNV事件的存在，当我们运用“RNA和DNA双外参实时定量荧光PCR检测方法”检测到某个基因在不同样本间具有相同的表观表达值(每个基因拷贝的表达量)，尽管该方法相对传统qPCR方法检测到了更加精确的表达水平，但仍然不能确定地判断该基因在细胞水平的表达量是否存在样本间差异。因此，如何能同时获得表观表达值和细胞水平表达值，并解析基因表达水平发生改变的机制性原因，成为急待解决的具有现实意义和理论意义的问题。
技术实现思路
为了解决上述技术问题，本专利技术提供了一种RNA和DNA双外参以及DNA内参实时定量荧光PCR检测方法，从而同时检测得到待测基因的表观表达水平、DNA拷贝数相对量以及细胞水平相对表达量。本专利技术的目的之一是提供了一种RNA和DNA双外参以及DNA内参实时定量荧光PCR检测方法，步骤如下:I)选定外参基因，配制具有一定比例的外参基因mRNA与DNA的预混合液；其中，所述外参基因为待测样品中不存在的序列。其中，所述外参基因的选定原则与预混液中外参基因mRNA与DNA的比值选择可参考专利.RNA和DNA双外参实时定量荧光PCR检测方法及其应用”(专利号:ZL200910049306.5)。2)选定内参基因，所述内参基因选自不容易发生拷贝数变异的CNV冷区的DNA序列。其中，所述内参基因的选定为，收集以往研究公开报道的“CNV冷区”序列信息，即不容易发生拷贝数变异的DNA区域序列数据。以大鼠为例，整条18号染色体均为CNV冷区[3’4];以人类基因组为例，从数据库-人类基因组为例，从数据库E.DATA,成为急待解决的具(http: / / dgv.tcag.ca / dgv / app / home)[5]中获取了人基因组中目前鉴定到的所有CNV序列信息，从人基因组全序列中扣除这些信息，即得到了 CNV冷区序列。3)将步骤I)制备的预混合液与待测样品混合，分别抽提总mRNA和总DNA ；4)总mRNA进行逆转录合成第一条cDNA链后与总DNA分别进行实时定量荧光PCR，扩增反应后，检测待测基因的mRNA和DNA的扩增产物的拷贝数、外参基因的mRNA和DNA的扩增产物的拷贝数，以及内参基因DNA扩增产物的拷贝数；根据如下公式计算分别得到待测基因的表观表达水平、待测基因的DNA拷贝数相对量、以及待测基因的细胞水平相对表达量:·本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种RNA和DNA双外参以及DNA内参实时定量荧光PCR检测方法，包括如下步骤：1)选定外参基因，配制外参基因mRNA与DNA的预混合液；所述外参基因为待测样品中不存在的序列；2)选定内参基因；3)将步骤1)制备的所述预混合液与待测样品混合，分别抽提总mRNA和总DNA；4)总mRNA进行逆转录合成第一条cDNA链后与总DNA分别进行实时定量荧光PCR扩增，检测待测基因的mRNA和DNA的扩增产物的拷贝数、外参基因的mRNA和DNA的扩增产物的拷贝数，以及内参基因DNA扩增产物的拷贝数，根据如下公式计算同时检测得到待测基因的表观表达水平、DNA拷贝数相对量以及细胞水平相对表达量：待测基因的细胞水平相对表达量＝待测基因的表现表达水平×待测基因的DNA拷贝数相对量。FDA0000419099250000011.jpg,FDA0000419099250000012.jpg

【技术特征摘要】
1.一种RNA和DNA双外参以及DNA内参实时定量荧光PCR检测方法，包括如下步骤: 1)选定外参基因，配制外参基因mRNA与DNA的预混合液；所述外参基因为待测样品中不存在的序列； 2)选定内参基因； 3)将步骤I)制备的所述预混合液与待测样品混合，分别抽提总mRNA和总DNA; 4)总mRNA进行逆转录合成第一条cDNA链后与总DNA分别进行实时定量荧光PCR扩增，检测待测基因的mRNA和DNA的扩增产物的拷贝数、外参基因的mRNA和DNA的扩增产物的拷贝数，以及内参基因DNA扩增产物的拷贝数，根据如下公式计算同时检测得到待测基因的表观表达水平、DNA拷贝数相对量以及细胞水平相对表达量: 2.如权利要求1所述的RNA和DNA双外参以及DNA内参实时定量荧光PCR检测方法，其特征在于，所述外参基因的DNA为包含外参基因的...

【专利技术属性】
技术研发人员：李园园，陆长德，蒋昊韡，
申请(专利权)人：上海生物信息技术研究中心，
类型：发明
国别省市：