本发明专利技术涉及通过酶的分离，从生物体组织中高收率地得到具有高的生物活性的细胞或细胞群的方法及用于其的探针。具体而言，本发明专利技术涉及生物体组织的分析方法，其特征在于，对于与特定的生物体成分结合的2种以上的蛋白质，将分别含有所述生物体成分结合域的2种以上的探针用于经分离的生物体组织上，分析所述各探针对于生物体组织的结合量。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】【专利摘要】本专利技术涉及通过酶的分离，从生物体组织中高收率地得到具有高的生物活性的细胞或细胞群的方法及用于其的探针。具体而言，本专利技术涉及生物体组织的分析方法，其特征在于，对于与特定的生物体成分结合的2种以上的蛋白质，将分别含有所述生物体成分结合域的2种以上的探针用于经分离的生物体组织上，分析所述各探针对于生物体组织的结合量。【专利说明】
本专利技术涉及通过酶分离由生物体组织高收率地得到具有高的生物活性的细胞或细胞群的方法，以及用于该方法的探针。
技术介绍
来自生物体组织的细胞和细胞簇的酶分离可用于包括移植该细胞或建立细胞系等各种目的，以及治疗、诊断和检查等广泛的用途。然而，为了解离生物体组织、分离其中含有的细胞或细胞集合体，有必要使细胞或细胞集合体游离至期望的程度，从而与细胞组织部分分离。从生物体组织分离细胞和细胞簇时，细胞间基质被胶原酶等蛋白质分解酶的混合物分解。生物体组织由细胞和细胞间基质构成。细胞间基质是固定细胞的物质，有结构物和非结构物。前者有胶原纤维、弹性纤维、细网纤维等纤维，后者为填充在纤维之间的成分，为称作底物的非溶胶的凝胶状物质，有糖蛋白和蛋白多糖。细胞间基质的代表是称为胶原(collagen)的蛋白质，占生物体内总蛋白质重量的约1/3。胶原具有纤维结构，正式地称为胶原纤维。组织大致分为上皮组织、支持组织、肌肉组织和神经组织4个类别。上皮组织是覆盖在身体表面的组织，细胞密度高，没有穿插细胞间基质。支持组织起着支持身体、脏器和细胞等的作用，包括结缔组织、软骨组织、骨组织、血液、淋巴。肌肉组织是以收缩运动为目的融合分化的细胞，细胞间基质所占的比例极低。肌肉组织由肌肉细胞、结缔组织、血管和神经构成，但是主要的结构物是肌肉纤维。神经组织主要由神经内膜和神经束膜构成，任一种均含有较多的细胞间基质(胶原)。结缔组织是支持组织的一种，由脂肪组织和纤维性结缔组织(以胶原纤维和弹性纤维为构成成分)组成，大致分为疏水性结缔组织和坚韧性结缔组织。疏水性结缔组织是胶原不规则排列的纤维性结缔组织，分布于皮下组织、粘膜组织、神经、血管外膜、小叶间组织等。根据生物物种、年龄、性别、组织、生活环境等，细胞间基质中胶原的含量情况不同。但是，在何种组织的何种状态的基质中以何种程度含有何种胶原仍不是十分明确。胶原的特征在于，构成蛋白质肽链的氨基酸具有如甘氨酸-氨基酸X-氨基酸Y”这样甘氨酸每3个残基重复一次的一级结构。据报道，人类的胶原蛋白质有30种以上，但是体内存在最丰富的是纤维性的I型胶原，非纤维性的IV型胶原的含量也很大，涉及通过分子间二硫键相互连接而形成网状结构(非专利文献I)。据报道，IV型胶原存在于胰岛和内分泌组织之间(非专利文献2、3)。认为特定类型的胶原是否存在于目标基质中，理论上可通过使用针对各种类型胶原的抗体进行免疫染色来确定。然而，胶原的种类较多，且广泛地存在于多细胞动物中，因此难以制作抗体等成为瓶颈，其实现是困难的。作为组织分解用的酶，来自溶组织梭菌的各种类型的粗胶原酶除了含有2种胶原酶之外，还含有各种蛋白酶(胶原分解活性和非特异性的蛋白质分解活性)和非蛋白酶成分(磷脂酶等)。通过这种粗胶原酶，各细胞和细胞群从生物体组织中酶法分离。据报道，各细胞或细胞群从生物体组织上酶法分离的时候，对于所分离的细胞或细胞群的收率及其生物活性，2种胶原酶(ColG和ColH)起重要作用，其用量比例有较大的影响(非专利文献4)。在从胰脏组织中分离胰岛的情况中，也使用由溶组织梭菌(Clostridium histolyticum)产生的2种胶原酶(非专利文献5、专利文献I和2)。本专利技术人现已确认，通过使2种胶原酶的用量比例最优化，可以分离大量的胰岛。据报道，胶原酶根据其种类而具有不同的胶原结合域(非专利文献6)。到目前为止，制备了各种功能性蛋白质和胶原结合域的融合蛋白质用于靶向和药物输送系统(DDS)。例如，可以列举在溶组织梭菌的胶原结合域中结合bFGF或EGF的胶原结合性细胞生长因子(非专利文献7)、源自牛血管性血友病因子的胶原结合十肽和TGF-β的融合蛋白质(非专利文献8和9)、在纤维连接蛋白的胶原结合域中结合功能性肽的缓释性细胞生长因子供给体(专利文献3)。如此，可制备与胶原结合域的融合蛋白质用于靶向和组织可视化目的，但不能用于生物体组织的分析和分离。为了对特定的组织和细胞进行无损伤分离，必须使所述组织和细胞周围存在的细胞间基质分解。然而，在进行必要的细胞表面分解的同时，无损伤地仅将细胞间基质通过酶进行分解是不容易的。特别是根据人类脏器的情况、年龄、性别、生活习惯、病史等，通过蛋白质分解酶获得的分解性不同，因此不得不通过经验确定酶的种类和酶反应时间而进行分离。在糖尿病患者中，移植从胰脏中分离的胰岛进行治疗(胰岛移植)。在胰岛移植中，必须分离存在于被称为胰岛的胰脏组织中的细胞团块，必须在不损伤胰岛的情况下分解胰脏组织，分离胰岛。然而，细胞间基质的状态根据动物种类、组织部位、个体年龄或性别、生长环境等而差别较大。特别是对于胶原，由老化导致的物性变化显著。尽管如此，对于不同状态的胰脏组织，根据规则适用一定用量比例的酶，仅改变分解时间，一边目测确认胰脏的分解程度，一边进行酶处理。因此，所得到胰岛的数量和质量根据医疗机构、医疗工作者、目标胰脏的状态而变。如果可以由待分离的细胞外基质或脏器的蛋白质组成来正确且简便地知晓所使用的蛋白质分解酶的种类和用量，则可在高活性的状态下分离目标细胞等。现有技术文献专利文献专利文献1W096/00283专利文献2W098/24889专利文献3W002/014505非专利文献非专利文献llnoueetal.，J Cell Biol, 97，1524-1539 (1983)非 专 利 文 献 2 S J Hughes, P McShane, TransplantProceedings, 37, 3444-34445(2005)非专利文献3SJ Hughes, A Clark, P McShane, Transplantation, 81 (3) 423-426 (2006)非专利文献4D Brandhorst et al., Transplantation Proceedings, 37 (8), 3450-3451(2005)非专利文献5E Linetsky et al.，Diabetes, 46，1120-1123 (1997)非专利文献6K Watanabe, Appl Microbiol Biotechnol, 63，520-526 (2004)非专利文献7NNishi, O Matsushita, K Yuube, H Miyanaka, A Okabe, F Wada, ProcNatl Acad Sci USA.;95 (12):7018-7023(1998)非专利文献8Tuan et al., Connective Tissue Reserch, 34 (I), 1-9 (1996)非专利文献9 H a n et al., Protein Expression andPurificationll, 169-178(1997)
技术实现思路
专利技术所要解决的问题本专利技术的本文档来自技高网...
【技术保护点】
生物体组织的分析方法，其特征在于，对于与特定的生物体成分结合的2种以上的蛋白质，将分别含有所述生物体成分结合域的2种以上的探针用于经分离的生物体组织上，分析所述各探针对于生物体组织的结合量。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：山形洋平，后藤昌史，渡边君子，
申请(专利权)人：国立大学法人东北大学，明治制果药业株式会社，
类型：
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。