通过测序分析进行的非侵入性胎儿遗传筛选制造技术

本发明专利技术提供一种非侵入性技术，其用于在含有来自不同基因组来源的遗传物质的生物样本中差异检测多个靶基因的多基因型和/或突变。使用来自生物样本的多个靶序列的多重扩增进行方法，测序用于在单个核苷酸水平上检测和计算遗传突变和染色体异常。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】通过测序分析进行的非侵入性胎儿遗传筛选相关申请本专利申请要求2010年10月26日提交的US临时专利申请系列号61/406，809的权益和优先权，其整个并入此处作为参考。关于联邦资助的研究或开发的声明本专利技术根据美国国立卫生研究院所颁发的协议0D000251得到美国政府的支持。政府在本专利技术中享有一定的权利。
本专利技术涉及从含有来自不同基因组来源的遗传物质的生物样本中的定量核酸分析领域。更具体地，本专利技术提供了一种非侵入性技术，用于在含有来自不同基因组来源的遗传物质的生物样本中差异检测基因型。
技术介绍
在母源体血液中可以检测到从胎盘脱落的胎儿DNA，其介于总DNA的3%和6%之间的水平。因此，已经描述了一些基于PCR的胎儿遗传筛选(例如，性别、Rh和地中海贫血)。然而，至少两个主要原因限制了传统技术--第一，PCR分析以灵敏度换取特异性，通常使其难以识别特定的突变，和第二，非整倍体，如唐氏综合征，不能由常规PCR在异源样本中检测。 避免基于PCR的分析的问题的方法之一是使用高度规模化技术通过大量DNA。这样的数字分析方法涉及到将提取的基因组物质分到离散的子样本中，从而靶序列检测为二进制(0，1)。例如，数字PCR允许扩增单个分子，随后进行定量分析。数字PCR通常需要在多孔格式中进行核酸的有限稀释，然后在孔中扩增核酸。数字PCR已应用于胎儿诊断，以便以超越常规PCR的特异性和敏感度来检测胎儿突变。然而，这样的方法经过优化用于分析生物样本中的单个靶，而且，在不询问样本中其它靶身份的情况下消耗样本。此外，数字PCR限于光学检测。因此，使用数字PCR的多重分析是不可行的，因为难以在一个给定孔中将多个靶的光信号区分开。此外，常规的数字分析不允许检测胎儿的单核苷酸多态性(SNP)，所述SNP对于胎儿广泛的疾病或病理情况是有提示性的。因此，需要改进的方法用于在单核苷酸水平上的对许多不同靶基因的多基因型和/或突变的非侵入性产前筛选。
技术实现思路
本专利技术提供了用于在含有来自至少两种不同基因组来源的遗传物质的样本中在多个不同靶区域中，精确测量基因组不稳定性的方法。本专利技术的方法涉及使用测序技术来数字计数异源生物样本中所含的一组被选择性扩增的靶。本专利技术的方法提供靶序列的数字计数，并通过序列读取比数字分析的传统方法给予更多的数据，如二进制输出数字PCR。因此，本专利技术的方法比常规筛选方法提供更高的检测率和改进的临床性能。本专利技术的方法可用于任何异源样本。本专利技术的方法特别用于遗传疾病的检测，以及特别用于胎儿遗传疾病的检测。此处所提供的方法可用于检测任何基因组不稳定性，如点突变或非整倍体(例如，三倍体、单倍体、复制、缺失、添加、重排、易位，或倒位)。本专利技术的方法优选在包含来自至少两种不同基因组来源的遗传物质的混合物的生物样本上进行。使用位于待讯问的区域两侧的引物扩增样本中的多个靶序列。然后直接测序扩增的靶序列，计数扩增子。最后，通过和参考进行比较来分析结果。例如，可以比较多个扩增的靶序列的比来检测非整倍体；或序列信息可以和参考序列或获自另一样本的序列进行比较。因此，母源序列(例如，从颊拭子获得)可以作为参考，或参考可以来自另一个体或来自共有序列。不同于数字PCR、或其它的数字分析方法，本专利技术方法的进行无需首先稀释生物样本或将生物样本中遗传物质的混合物分配至离散的子样本中。通过同时扩增来自含有来自不同基因组来源的遗传物质的混合物的异源生物样本的多个靶序列部分地进行本专利技术的方法。然后，遗传物质的扩增混合物直接测序以便数字计数扩增链(一条链一个读取)。优选,用单分子测序技术,特别是边合成边测序(sequencing-by-synthesis)技术进行本专利技术的方法。测序技术来数字计数靶序列的扩增链允许检测胎儿SNP，以及染色体异常从而检测广泛的胎儿疾病。可用于本专利技术方法的合适边合成边测序平台包括但不限于真实的单分子测序(tSMS?)技术比如Helicos Inc.(Cambridge, MA)提供的HeliScope?测序仪、单分子实时(SMRT?)技术比如 Pacific Biosciences (California)提供的 PacBio RS 系统、以及大规模并行测序技术比如 Illumina Inc.(San Diego, California)提供的 HiSEQ2000 系统。选定靶序列的同时扩增允许操作者为每个家长定制产前筛查测试。对于可用本专利技术方法分析的靶序列数目没有任何限制。本专利技术提供了对多个靶基因的多基因型和/或突变的分析。此外，可以从有限数目的生物样本分析无限数目的靶序列，而不需要进行富集。尽管，在靶序列扩增和/或测序之前，任选富集一个或多个基因组序列群。例如，可以使用本专利技术的方法分析来自无论何处的2到100+个靶序列。可根据本专利技术的方法对各种遗传异常进行差异检测，包括一个或多个靶序列中的突变、缺失、插入、重排、复制、易位和倒位。本专利技术尤其用于检测SNP，以及非整倍体(包括整个染色体的复制和缺失)。包含来自不同基因组来源的遗传物质的混合物的异源生物样本的实例包括血液、血液组分(fraction)(例如，血浆)、唾液、痰、尿、精液、阴道液、汗、乳汁、乳房液、脑脊液、大便、细胞或组织活检。在一般情况下，本专利技术用于检测具有来自多基因组来源的核酸的样本中的核酸。在一个【具体实施方式】中，异源生物样本是来自怀孕女性的外周血，特别是来自外周血的血浆。将遗传物质构成生物样本的不同基因组来源可以来自怀孕女性和胎儿、非癌细胞或组织和癌细胞或组织，或来自供体组织和移植受体组织。因此，本专利技术的方法尤其用于在母源外周血中使用无细胞胎儿DNA进行的非侵入性产前筛选遗传突变，尤其用于检测胎儿SNP和染色体异常。然而，本领域技术人员认识到本专利技术的方法也可用于在血液、大便、痰、尿、阴道液、乳头吸出物、脑脊液等中使用无细胞核酸来筛选和癌症有关的一组靶基因。本专利技术的方法也可用于在供体和移植受体组织中筛选各种靶基因的多基因型和/或突变。【附图说明】图1是体现通过测序进行的胎儿基因分型的示意图。图2是一张描述理论平均的图，其假设针对一个突变的母源携带者以及临床相关胎儿状态之间的匹配。ε是可检测到的等位基因分数(fraction)，这与纯合子胎儿中野生型和突变等位基因之间的差异相同。图3是一张描述对于给定条件理论上基于标准偏差的数目的图。图4是一张描述使用数字测序技术时来校正扩增偏倚(bias)的方法的示意图。【具体实施方式】1.概述此处描述的方法和材料将技术用于分析包含在含有来自不同基因组来源的遗传物质的混合物的生物样本中的大量靶DNA序列，并允许在单核苷酸水平检测不同靶DNA序列之间的差异。不同于在其中样本中DNA被分离成小反应体积中名义上的单个靶分子的其它数字分析方法，进行本专利技术的方法无需稀释或分散样本中的遗传物质。本专利技术的方法允许同时筛选无限数目靶基因的多基因型和/或突变，并在单核苷酸水平上为每个靶基因提供提示性的序列信息，从而提供在受试者中从有限的生物样本数目中非侵入性的、高通量筛选广泛疾病或病理情况的能力。在一个【具体实施方式】中，本专利技术的方法涉及分析在母源血液中混合的胎儿和母源DNA，从而从母源DNA背景中鉴定出胎儿的突变或遗传异常本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种差异检测生物样本中的靶序列的方法，所述生物样本包括来自不同基因组来源的遗传物质的混合物，所述方法包括步骤：a）获得含有来自不同基因组来源的遗传物质混合物的生物样本；b）无需将遗传物质的混合物分散至离散的反应样本中，扩增来自生物样本的多个靶序列以便获得含有来自不同基因组来源的遗传物质的混合物的扩增样本；c）对扩增样本中遗传物质的混合物进行测序；d）对扩增样本中扩增的靶序列的数目进行计数；以及e）进行分析，其中比较扩增样本中扩增的靶序列的比来确定生物样本中不同靶序列的相对量。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2010.10.26 US 61/406,8091.一种差异检测生物样本中的靶序列的方法，所述生物样本包括来自不同基因组来源的遗传物质的混合物，所述方法包括步骤: a)获得含有来自不同基因组来源的遗传物质混合物的生物样本； b)无需将遗传物质的混合物分散至离散的反应样本中，扩增来自生物样本的多个靶序列以便获得含有来自不同基因组来源的遗传物质的混合物的扩增样本； c)对扩增样本中遗传物质的混合物进行测序； d)对扩增样本中扩增的靶序列的数目进行计数；以及 e)进行分析,其中比较扩增样本中扩增的靶序列的比来确定生物样本中不同靶序列的相对量。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述生物样本是血液、血液组分、唾液、痰、尿、精液、阴道液、脑脊液、大便、细胞或组织活检。3.根据权利要求2所述的方法，其中所...

【专利技术属性】
技术研发人员：S·R·夸克，W·顾，Hm·C·范，
申请(专利权)人：利兰·斯坦福青年大学托管委员会，
类型：
国别省市：