本发明专利技术涉及一种免标记适配体传感检测超低浓度赭曲霉毒素A的方法，具体步骤为以邻氨基苯硫酚功能化的氧化石墨烯（GO-SH）和氯金酸为起始原料，以柠檬酸钠为还原剂一锅法制备金纳米粒子修饰的功能化还原氧化石墨烯（Au-S-rGO），以Au-S-rGO为载体负载经巯基修饰的单链DNA3得到DNA3-Au-S-rGO。然后在金电极表面修饰经巯基修饰的单链DNA1，并通过碱基互补配对将适配体（DNA2）修饰到电极表面，然后将该传感界面与不同浓度的OTA反应。优点为：提供一种制备工艺简单，灵敏度高，测量范围宽，成本低的定量检测OTA的方法，解决现有检测成本高、检测方案复杂、检测时间过长、灵敏度较低的难题。
【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术涉及一种免标记适配体传感检测超低浓度赭曲霉毒素A的方法，具体步骤为以邻氨基苯硫酚功能化的氧化石墨烯（GO-SH）和氯金酸为起始原料，以柠檬酸钠为还原剂一锅法制备金纳米粒子修饰的功能化还原氧化石墨烯（Au-S-rGO），以Au-S-rGO为载体负载经巯基修饰的单链DNA3得到DNA3-Au-S-rGO。然后在金电极表面修饰经巯基修饰的单链DNA1，并通过碱基互补配对将适配体（DNA2）修饰到电极表面，然后将该传感界面与不同浓度的OTA反应。优点为：提供一种制备工艺简单，灵敏度高，测量范围宽，成本低的定量检测OTA的方法，解决现有检测成本高、检测方案复杂、检测时间过长、灵敏度较低的难题。【专利说明】一种免标记适配体传感检测超低浓度赭曲霉毒素A的方法
本专利技术涉及一种纳米金修饰的巯基化还原氧化石墨烯复合材料的合成方法及其作为标记物用于超低浓度赭曲霉毒素A (ochratoxin A，OTA)检测的电化学适配体传感器的制备方法，属于生物分子识别和纳米材料辅助信号放大
。
技术介绍
OTA是由曲霉和青霉菌代谢产生的一种具有多种毒性的真菌毒素，稳定性强，不易降解，广泛存在于粮食、饲料和谷类食物中。动物食用了含有OTA的饲料会导致体内毒素残留从而使肉制品被污染，这些残留的OTA也可以经由食物链进入人体，从而对人类健康及农业经济发展造成严重威胁。研究资料表明，OTA具有肾毒性、肝毒性、免疫毒性、基因毒性等，并且主要是通过促进膜的过氧化反应，抑制线粒体的呼吸作用和影响细胞信号传导通路中蛋白及关键因子的转录表达等来达到致毒效应。在已报道的真菌毒素中，OTA对人类的危害性仅次于黄曲霉毒素，国际癌症研究机构将其定义为2B类致癌物。目前存在的OTA的检测方法有很多，主要包括薄层层析法、高效液相色谱法、免疫测定法等。薄层层析法的优点是方法简单，使用的试剂价格便宜，但是存在灵敏度较差，所需试剂繁多，检测周期长，重现性不好和无法实现自动化等缺点，已不能满足现代检测的要求。色谱法可以用于定性、定量检测，且检测结果相对准确、可靠，灵敏度高，重现性好，但是所用仪器价格昂贵，操作复杂且不适合用于大批量样品的检测，而且不能用于现场的快速检测。现场快速筛选方法以酶联免疫吸附法较多。但这种方法是基于抗原-抗体的亲和反应，以抗体作为识别分子，但由于抗体容易受到外界环境尤其是温度的影响，限制了该方法的推广。另一方面，抗体制备也需经过动物实验或者细胞实验，繁琐耗时，制备成本高，检测成本也高。本专利技术以核酸适配体为识别元件用于OTA的电化学阻抗法检测。首先将金电极表面修饰上经巯基修饰的DNA、适配体及DNA功能化的金纳米粒子修饰的还原氧化石墨烯复合材料，大大提高了传感器的灵敏度和检测线性范围。该检测体系以修饰的金电极为工作电极，Ag/AgCl电极为参比电极，钼电极为对电极，以电化学阻抗图谱为检测信号，通过对不同浓度OTA标准品检测，建立标准曲线，以达到对含OTA的样品进行定量检测的目的。
技术实现思路
技术问题:本专利技术旨在专利技术一种集免标记、高灵敏度、高选择性、简单易操作等优点为一体的电化学适配体传感器，提供一种制备工艺简单，灵敏度高，测量范围宽，成本低的定量检测OTA的方法，解决现有检测成本高、检测方案复杂、检测时间过长、灵敏度较低的难题。技术方案:以邻氨基苯硫酚功能化的氧化石墨烯(GO-SH)和氯金酸为起始原料，以柠檬酸钠为还原剂一锅法制备金纳米粒子修饰的还原氧化石墨烯(Au-S-rGO)，以Au-S-rGO为载体负载经巯基修饰的DNA3得到DNA3_Au-S_rG0。然后在金电极表面修饰经巯基修饰的单链DNA1，并通过碱基互补配对将适配体(DNA2)修饰到电极表面，然后将该传感界面与不同浓度的OTA反应，由于在OTA存在的情况下，本专利技术中所述适配体与OTA会发生特异性结合而从电极表面脱离，残留的适配体将与DNA3发生杂交反应，进而将DNA3-Au-S-rG0捕获在电极表面形成传感界面。由于Au-S-rGO表面可以通过两种方式(基于J1- Ji作用的吸附和Au-S的共价键合)负载大量的DNA3，少量的适配体就可以将大量的DNA3修饰在电极表面。而DNA链上的磷酸骨架所带的负电荷排斥带有同种电荷的氧化还原探针3_/4_，阻碍了 3_/4_在界面上的电子传递，从而导致电荷转移电阻(O增大。通过对不同浓度的OTA标准品进行电化学阻抗法检测，建立阻抗值与OTA浓度之间的关系，以达到对含OTA的样品进行定量检测的目的。具体的技术解决方案如下: (I)氧化石墨烯表面巯基化:首先通过Hmnmers法制备氧化石墨烯(G0),然后将GO与1- (3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)按质量比1:20:20在乙醇溶液中混合，室温下反应8 h，并不断进行搅拌。再将过量的邻氨基苯硫酚加入到上述反应体系中室温下继续搅拌12 h，邻氨基苯硫酚的加入量为:按GO:邻氨基苯硫酚质量比为1:40加入，反应结束后，用乙醇洗涤，离心后弃去上清液，用无水乙醇和水分别洗涤、离心数次，真空干燥后得到巯基化的氧化石墨烯(G0-SH)。(2)金纳米粒子修饰的GO-SH复合材料的合成:称取步骤(I)中得到的G0-SH，超声分散在二次蒸馏水中，其中按每20 mL 二次蒸馏水加入10 mg步骤(I)中得到的G0-SH，然后转移到三孔烧瓶中搅拌状态下加热回流0.5 h。再将新鲜配制的柠檬酸钠溶液(25mg.ml/1)缓慢加入到三孔烧瓶中，其中按每20 mL 二次蒸馏水加入5 mL新鲜配制的柠檬酸钠溶液，继续加热回流2.5 h。最后将氯金酸溶液(2 wt%)加入到上述反应物中，其中按每20 mL 二次蒸馏水加入150 μ L氯金酸溶液，继续加热回流0.5 h后，停止加热，搅拌状态下冷却至室温。经水洗、离心后得到金纳米粒子修饰的GO-SH复合材料(Au-S-rGO)，并重新分散在二次蒸馏水中备用。(3)单链HS-DNA3修饰的Au-S-rGO的制备:将100 mM HS-DNA3储备液加入到步骤(2)中得至Ij的Au-S-rGO分散液(2 mg.ml/1)中，其中按每I mL步骤(2)中得到的Au-S-rGO分散液加入45 μ L HS-DNA3，室温孵育、振荡24 h，然后加入2 M NaCl溶液，按每I mL步骤(2)中得到的Au-S-rG0分散液加入100 μ L NaCl溶液，继续振荡24 h，反应结束后，用二次蒸馏水洗、离心若干次，将产物(DNA3-Au-S-rG0)重新分散在Tris-HCl缓冲溶液中备用。(4)金电极表面预处理:将金盘电极依次用I μ m、0.05 μ m的氧化铝粉末进行打磨处理，然后在二次蒸馏水中超声清洗3 min，再在0.1 M H2SO4溶液中进行循环伏安扫描，扫描电位区间为-0.2?1.6 V，扫速为0.05 V s—1，直至出现重复的伏安峰为止。清洗电极、氮气吹干备用。(5)电化学适配体传感器界面的修饰过程:首先将预处理的裸金电极浸入在5 μ M的HS-DNAl溶液中，室温下反应6 h，接着用0.05 M Tris-HCl缓冲溶液和二次蒸馏水淋洗，氮气吹干；然后将电极浸没在0.01本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种免标记适配体传感检测超低浓度赭曲霉毒素A的方法，按下述步骤进行：以邻氨基苯硫酚功能化的氧化石墨烯（GO?SH）和氯金酸为起始原料，以柠檬酸钠为还原剂一锅法制备金纳米粒子修饰的功能化还原氧化石墨烯（Au?S?rGO），以Au?S?rGO为载体负载经巯基修饰的DNA3单链得到DNA3?Au?S?rGO；然后在金电极表面修饰经巯基修饰的单链DNA1，并通过碱基互补配对将适配体DNA2修饰到电极表面，然后将该传感界面与不同浓度的OTA反应；其中：单链?DNA1序列：5“–HS–TGT?CCG?ATG?CTC–3“；适配体?DNA2序列：5“–GAT?CGG?GTG?TGG?GTG?GCG?TAA?AGG?GAG?CAT?CGG?ACA–3“；?单链?DNA3序列：5“–CCA?CAC?CCG?ATC–SH–3“。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王坤，钱静，姜玲，
申请(专利权)人：江苏大学，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。