本发明专利技术公开了一种用于快速检测猕猴桃软腐病原菌的特异性引物及其检测方法，解决现有的技术手段无法快速、准确地检测出猕猴桃软腐病原菌的问题。该引物包括BZY-1和BZY-2，其序列分别为：5′-CCATCAAACTCCAGTCAGTAAACG-3′、5′-CTGCGCTCCGAAGCGAGATGTATG-3。该检测猕猴桃软腐病原菌的方法，包括：（1）提取样品的DNA；（2）以样品DNA为模板，配于引物BZY-1、引物BZY-2、2×TaqPCRMasterMix、无菌超纯水混匀并进行PCR扩增；（3）对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，并根据是否扩增出条带而判定样品中是否存在猕猴桃软腐病原菌。本发明专利技术中的引物特异性极强，只能扩增出猕猴桃软腐病菌，其只需将在待检测猕猴桃果实组织中提取的基因组DNA进行PCR扩增检测后，根据电泳图观察其是否扩增出条带即可判定该组织上是否存在猕猴桃软腐病原菌。
【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术公开了一种用于快速检测猕猴桃软腐病原菌的特异性引物及其检测方法，解决现有的技术手段无法快速、准确地检测出猕猴桃软腐病原菌的问题。该引物包括BZY-1和BZY-2，其序列分别为：5′-CCATCAAACTCCAGTCAGTAAACG-3′、5′-CTGCGCTCCGAAGCGAGATGTATG-3。该检测猕猴桃软腐病原菌的方法，包括：（1）提取样品的DNA；（2）以样品DNA为模板，配于引物BZY-1、引物BZY-2、2×TaqPCRMasterMix、无菌超纯水混匀并进行PCR扩增；（3）对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，并根据是否扩增出条带而判定样品中是否存在猕猴桃软腐病原菌。本专利技术中的引物特异性极强，只能扩增出猕猴桃软腐病菌，其只需将在待检测猕猴桃果实组织中提取的基因组DNA进行PCR扩增检测后，根据电泳图观察其是否扩增出条带即可判定该组织上是否存在猕猴桃软腐病原菌。【专利说明】用于快速检测獅猴桃软腐病原菌Botryosphaer i adoth idea的特异性引物及其检测方法
本专利技术涉及一种植物病原真菌的检测方法，尤其涉及一种用于快速检测猕猴桃软腐病原菌AoiiTO1SMaeria doth idea的特异性引物及其检测方法,用于快速、准确地对称猴桃果实中是否存在猕猴桃软腐病原菌进行检测。
技术介绍
果实采后腐烂是一个全球性问题，在世界范围内新鲜水果贮藏过程中有25%~30%以上因腐烂变质而不能利用。果实采后腐烂原因主要是果实在采后加工、运输、贮存以及销售过程中，由病原菌侵染所致。随着我国水果产业的发展，种植面积的扩大，采后水果腐烂逐步得到重视。但是由于采前病害防治不彻底以及贮运技术的落后，使得采后水果腐烂的情况日益加剧。猕猴桃采后贮藏期病害有软腐病、蒂腐病、青霉病，目前鉴定出的病原菌为:Botryosphaeria do thi dea > Phomopsi 5 sp.^Bo tryti s cinerea 与 Penicillium i tali cum 0这些病菌大多通过伤口侵入果实，导致贮运期间果实大规模腐烂，一般发病率在20%左右，严重时能达到50%。其中由于猕猴桃软腐病在贮藏期传染速度极快，潜伏期短，危害也最为严重。Cryptosporiopsis、Diaporthe、Cylindrocarpon、Phoma、Botrytis^Alternaria、Mucor和Sclerotinia等属真菌都曾被报道与称猴桃软腐病相关,但均未用柯赫氏法则来验证这些真菌是否是称猴桃软腐病的病原菌。目前只有与Botryosphaeriado thi dea已被证实是引起称猴桃软腐病的病原,但/iAoffioASi1SSp.只能通过伤口侵染称猴桃，而汉WAi而a则可直接从果皮侵入到猕猴桃果实中。由汉WAi而a引起的猕猴桃软腐病十分普遍，在中国、新西兰、韩国及日本等国均有报道。猕猴桃果实感染软腐病原菌(.B.t/oiAiofea)后,发病部位初期呈圆形,病斑中央褐色,病健交界处呈暗绿色。病斑表面无凹陷，用手按压，明显感觉病部果肉变软，果实其他部分组织随着发病进程迅速变软。发病后期病部产生白色菌丝，病部有`组织液渗出。剥开皮层可见病部果肉变黄且病健交界处呈水溃状，中间常有乳白色至浅粉红色的锥形腐烂。果实在发病后7~9 d内可导致整个果实完全腐烂。由于猕猴桃软腐病发病快，一旦发病则极难防治，容易造成巨大的经济损失。所以，病原的快速鉴定和检测可为病害的正确诊断和早期防治提供参考。传统的检测方法主要依靠菌落形态，发病症状等方法进行，不能快速、准确地检测到病原菌的存在，从而导致病害的误诊和防治延误。虽然利用分子序列比对来鉴定病原物是一种可靠的方法，但从病原菌的培养到PCR扩增产物送出测序以及序列信息返回需要一定周期。这对于传染速度快且危害严重的软腐病来说，需要寻找更加快速准确的方法。利用种特异性引物检测病原菌具有快速、准确的优点，已经为病害的诊断和早治提供了很多成功的事例。Ni和Yang等人于2012年发表一对基于内转录间隔区(The ribosomalinternal transcribed spacers, ITS)^ Fusicoccum aesculi(Botryosphaeria do thi dea的无性态)特异性引物Bd318F/Bd318R，但是使用NCBI基因库的BLAST功能验证引物特异性结果表明，其E value (代表被比对的两个序列不相关的可能性,E value越低，引物特异性越高)高达28，引物特异性非常低。并且Bd318F/Bd318R引物需要巢式PCR反应体系，因此，其便利性差。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种用于快速检测称猴桃软腐病原菌So tryosphaeriado thi dea的特异性引物及其检测方法，主要解决现有的技术手段无法快速、准确地检测出猕猴桃中是否存在猕猴桃软腐病原菌的问题。为了实现上述目的，本专利技术采用的技术方案如下: 用于快速检测称猴桃软腐病原菌Botryosplmeria do thi dea的特异性引物,包括一组引物BZY-1和BZY-2，其中，BZY-1为正向引物，BZY-2为反向引物，二者的序列分别如下:BZY-1:5/ -CCATCAAACTCCAGTCAGTAAACG-3'；BZY-2:5/ - CTGCGCTCCGAAGCGAGATGTATG-3。在上述基础上，本专利技术还提供了该用于快速检测猕猴桃软腐病原菌Bo tryosphaeri a do thi dea的方法，包括以下步骤: (1)提取待检测果实样品的DNA； (2)以待检测果实样品的DNA为模板，配于引物BZY-1、引物BZY-2、2X Taq PCR MasterMix、无菌超纯水混匀并进行 PCR扩增，其中，模板DNA、引物BZY-1、引物BZY-2,2XTaq PCRMaster Mix和无菌超纯水的容积分别为:0.5~I μ L、0.5~I μ L、0.5~I μ L、12.5 μ L、9.5~11 μ L，并且模板DNA、引物BZY-1和引物BZY-2的浓度分别为10~100ng/L、10 μ mol/L、10 μ mol/L ； (3)对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，并根据是否扩增出条带而判定样品中是否存在猕猴桃软腐病原菌。具体地说，所述步骤(1)中待检测果实样品的DNA采用CTAB法提取，其提取方式包括以下步骤: (Ia)称取质量为lg、且在_60°C条件下冷冻后的猕猴桃果实样品，放入研钵里并加入液氮研磨成细末，并迅速将该细末转移至IOmL的离心管中，同时加入3mL预热至65°C的2 X CTAB和10 μ L的2-巯基乙醇，混匀； (Ib)将混匀后的产物置于65°C下水浴Ih后取出离心管，待冷却至室温后加入等体积的由三氯甲烷和异戊醇混合的混合液，颠倒混匀lOmin。(Ic)在10000rpm/min条件下离心lOmin，取上清液移至另一无菌的5mL离心管中，并加入与上清液相同体积的由三氯甲烷和异戊醇混合的混合液轻轻混匀IOmin ； (Id)在10000rpm/min条件下离心lOmin，取上清液移至另一本文档来自技高网...
【技术保护点】
用于快速检测猕猴桃软腐病原菌Botryosphaeria?dothidea的特异性引物，其特征在于，包括一组引物BZY?1和BZY?2，其中，BZY?1为正向引物，BZY?2为反向引物，二者的序列分别如下：BZY?1：5′?CCATCAAACTCCAGTCAGTAAACG?3′；BZY?2：5′??CTGCGCTCCGAAGCGAGATGTATG?3。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：龚国淑，何书婷，周游，徐文俊，张敏，陈华保，唐贵婷，叶梦萍，彭丹丹，
申请(专利权)人：四川农业大学，
类型：发明
国别省市：
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