本发明专利技术公开了一种胞外α-酮戊二酸产量提高的解脂亚洛酵母基因工程菌，属于代谢工程领域。本发明专利技术从Yarrowia?lipolytica?CLIB122全基因组范围内的6611条蛋白质编码序列中筛选得到4条编码转运蛋白的基因，通过在解脂亚洛酵母（Y.lipolytica）WSH-Z06中分别过量表达这4个基因，获得了细胞外α-酮戊二酸含量提高的重组菌。本发明专利技术通过过量表达这类基因增强了细胞将α-酮戊二酸转运至细胞外能力，降低下游分离纯化成本。
【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术公开了一种胞外α-酮戊二酸产量提高的解脂亚洛酵母基因工程菌，属于代谢工程领域。本专利技术从Yarrowia?lipolytica?CLIB122全基因组范围内的6611条蛋白质编码序列中筛选得到4条编码转运蛋白的基因，通过在解脂亚洛酵母（Y.lipolytica）WSH-Z06中分别过量表达这4个基因，获得了细胞外α-酮戊二酸含量提高的重组菌。本专利技术通过过量表达这类基因增强了细胞将α-酮戊二酸转运至细胞外能力，降低下游分离纯化成本。【专利说明】—种胞外α-酮戊二酸产量提高的解脂亚洛酵母基因工程菌
本专利技术涉及一种胞外α-酮戊二酸产量提高的解脂亚洛酵母基因工程菌，属于代谢工程领域。
技术介绍
α-酮戊二酸作为三羧酸循环(TCA)途径中重要中间产物之一，在微生物细胞的代谢中起着重要的作用，不仅是三羧酸循环中的关键节点，在生物体内参与氨基酸、蛋白质、维生素的合成以及能量代谢；而且是微生物调控碳氮代谢平衡的重要节点，在研究与微生物氮代谢相关的调控机制方面具有重要作用。在工业上，α-酮戊二酸是重要的精细化工和医药工业的中间体，广泛用于合成多种氨基酸、维生素和其它小分子物质，在医药、有机合成、营养强化剂等领域都有着重要的应用前景。 由于α-酮戊二酸在微生物胞内代谢中的特殊地位，筛选得到的α-酮戊二酸生产菌株，在高产α-酮戊二酸的同时，在发酵终期仍然会积累大量丙酮酸等代谢副产物。α -酮戊二酸、丙酮酸等短链酮酸是弱电解质，在不同的pH条件下会以分子和阴离子两种状态存在。在发酵过程中，α-酮戊二酸多以解离的阴离子状态存在。由于胞质中积累过量的羧酸阴离子会引起胞质的酸化而导致细胞代谢的中断，阴离子形式存在的α -酮戊二酸只有借助羧酸转运蛋白从胞质中被转运至胞外。而在细胞缺乏碳源时，羧酸转运蛋白又会将胞外的特定蛋白转运到胞内作为碳源使用。类似的，其他中心代谢途径相关的羧酸也存在类似的分泌和吸收过程。因此，细胞膜上特定羧酸转运蛋白的动力学性质及其调控过程，对发酵液和胞内相应羧酸的积累具有决定性作用。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种胞外α -酮戊二酸产量提高的基因工程菌，是在解脂亚洛酵母(Yarrowia lipolytica)WSH-Z06中过量表达编码酮酸转运蛋白的基因。所述基因的核苷酸序列如以下(I)或(2 )或(3 )或(4 )所示:(I)NCBI登录号为YAL10B19470g的核苷酸序列，(2) NCBI登录号为YAL10C21406g的核苷酸序列，(3) NCBI登录号为YAL10D20108g的核苷酸序列，(4) NCBI登录号为YAL10E32901g的核苷酸序列。所述基因优选NCBI登录号为YAL10B19470g的核苷酸序列，过量表达该基因的Y.lipolytica WSH-Z06的胞外α -酮戊二酸产量提高、丙酮酸含量下降。所述解脂亚洛酵母Y.lipolytica WSH-Z06从中国典型培养物保藏中心获得，菌种编号为 CCTCC NO:M20714o所述基因工程菌的构建方法是:(1)构建表达目的基因所用的含有潮霉素磷酸转移酶为筛选标记的整合型表达载体PO (hph) ；(2)构建重组整合型表达质粒:根据NCBI公开的序列，全化学合成目的酮酸转运蛋白基因的开放阅读框序列，并通过限制内切酶BamHI和Eco RI (或者Not I和Eco RI)同时切割获得的开放阅读框部分和整合型表达载体pO (hph),连接获得重组表达质粒；(3)将所得重组整合型表达质粒转化Y.lipolyticaWSH-Z06:利用电穿孔转化方法将被限制性内切酶Avr II线性化的重组质粒转化野生型Y.lipolyticaWSH_Z06,验证筛选阳性转化子。以所述基因工程菌发酵生产α -酮戊二酸的方法，将所得重组基因工程菌接种至种子培养基中，28°C、200rpmin，培养16-18小时；按10%的接种量从种子培养基中接种到3-L发酵罐中，培养温度为28°C、通气量为1.5vvm，搅拌转数为400rpm，培养144-168小时。与未过量表达酮酸转运蛋白基因的对照菌相比:过量表达YAL10B19470g、YAL10C21406g、YAL10D20108g、YAL10E32901g基因的重组菌株的细胞外α -酮戊二酸含量从 16.6g.L-1 分别上升至 26.7,18.6,24.0 和 19.0g.L-1本专利技术的有益之处:本专利技术通过筛选，首次获得了 4条能够提高Y.lipolytica细胞外α-酮戊二酸含量的酮酸转运蛋白基因，通过过量表达这类基因能增强细胞将α-酮戊二酸转运至细胞外能力，降低下游分离纯化成本。【专利附图】【附图说明】图1酮酸诱导培养及酮酸转运蛋白表达水平变化;Α:以丙酮酸或α -酮戊二酸为单一碳源处理野生细胞其细胞内丙酮酸(〇)和α -酮戊二酸(Λ )含量变化；Β:丙酮酸或α-酮戊二酸为单一碳源处理过程中转运蛋白表达水平变化。图2酮酸转运蛋白同源性分析图3重组Y.lipolytica验证；A:转运蛋白过量表达转化子验证图，通道1:Y.lipolytica Tl,通道 2:Υ.lipolytica T2,通道 3:Υ.lipolytica T3,通道 4:Y.lipolytica T4,通道 5:Y.lipolytica T5,通道 6:Υ.lipolytica T6,通道 7:阴性对照；B:重组菌株中转运蛋白表达水平变化。图4重组菌株细胞外酮酸含量【具体实施方式】材料与方法YPD培养基(g.L-1):蛋白胨10，酵母浸膏5，葡萄糖10，固体培养基另加20g.L-1琼脂。转化子筛选时加入潮霉素B至终浓度为400mg.L'YPK 培养基(g.L-1): α -酮戊二酸 100，Yeast Nitrogen Basel.7，(NH4) 2S045,用2mol.T1NaOH 调节 pH 至 5.0。YPP 培养基(g.L-1):丙酮酸 50，Yeast Nitrogen Basel.7，(NH4)2S045,用2mol.T1NaOH 调节 pH 至 5.0。种子培养基(g.I/1):葡萄糖 20，蛋白胨 10，MgSO4.7Η200.5，KH2PO4L O。用稀盐酸调pH至5.5，115°C维持15min灭菌。固体斜面另添加20g.L-1琼脂粉。发酵培养基(g.I/1):甘油 100，(NH4)2S043，KH2P043，MgSO4.7Η201.2，NaCl0.5，K2HPO40.1，盐酸硫胺素 2Χ10_7,ρΗ=4.5。115°C，灭菌 15min。接种前加入 121°C灭菌 30min的CaCO3至含量为20g.L-1。解脂亚洛酵母Y.lipolytica WSH-Z06从中国典型培养物保藏中心CCTCC获得，菌种编号为 CCTCC NO:M20714o酮酸含量测定:将发酵液在12000g离心5min后，取上清液，用超纯水稀释50倍，HPLC检测。细胞内酮酸含量测定:离心收集细胞，用0.9%生理盐水洗涤，用IOmL0.1mol.L-1KH2PO4-K2HPO4, Immol.L_1EDTA,0.01mmol.L-1DTT ρΗ7.5 缓冲液悬浮细胞，加入石英砂研磨5mi本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种胞外α?酮戊二酸产量提高的基因工程菌，其特征在于，是在解脂亚洛酵母（Yarrowia?lipolytica）WSH?Z06中过量表达编码酮酸转运蛋白的基因。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：陈坚，郭洪伟，周景文，堵国成，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：
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