一种小菜蛾抗菌肽moricin及其制备方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种小菜蛾抗菌肽moricin及其制备方法与应用。所述小菜蛾抗菌肽moricin基因的核苷酸序列如SEQIDNO：1～2所示；其编码的氨基酸序列如SEQIDNO：3所示。经序列分析发现小菜蛾抗菌肽moricin的成熟肽的氨基酸序列如SEQIDNO：4所示。将小菜蛾抗菌肽moricin的成熟肽基因进行真核表达，得到的重组成熟肽对出芽短梗霉具有显著的抑制或杀死作用，可应用于制备抑制或杀死出芽短梗霉的制剂。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术公开了一种小菜蛾抗菌肽moricin及其制备方法与应用。所述小菜蛾抗菌肽moricin基因的核苷酸序列如SEQIDNO：1～2所示；其编码的氨基酸序列如SEQIDNO：3所示。经序列分析发现小菜蛾抗菌肽moricin的成熟肽的氨基酸序列如SEQIDNO：4所示。将小菜蛾抗菌肽moricin的成熟肽基因进行真核表达，得到的重组成熟肽对出芽短梗霉具有显著的抑制或杀死作用，可应用于制备抑制或杀死出芽短梗霉的制剂。【专利说明】—种小菜蛾抗菌肽mor icin及其制备方法与应用
本专利技术属于基因工程
，具体涉及一种小菜蛾抗菌肽moricin及其制备方法与应用。
技术介绍
抗菌肽(antibacterial peptide)是生物体内经诱导产生的一类具有生物活性的小分子多肽，存在于多种生物体中，是宿主免疫防御系统的一个重要组成部分(Boman andHultmark, 1987; Bulet et al.，2004)。抗菌肽不仅能抑制细菌生长，某些抗菌肽对部分真菌、原虫、病毒及癌细胞等均具有强有力的杀伤作用，甚至有一定的免疫调节功能，能加速伤口愈合，且不会产生耐药性。而且绝大多数抗菌肽对哺乳动物正常细胞无害，并且其杀菌机制与传统抗生素完全不同，被学者们认为是一种天然抗生素而备受青睐。随着研究的不断深入，越来越显示出了其在人类医学、兽医学等领域的独特应用价值(Boulanger etal., 2006; Bulet et al., 2004)。Moricin首次从家香血淋巴中分离得到，命名为moricinl和moricinAl,是一类新的抗菌肽(Hara and Yamakawa, 1995),两者在核苷酸序列上有97.2%的相似性，唯一的不同是moricin-l信号肽的第六个氨基酸苯丙氨酸在moricin-2中变更为赖氨酸,但它们的成熟蛋白氨基酸序列是完全相同的。Moricin是一类由42个氨基酸残基组成的抗菌肽，高碱性，在结构上与其它抗菌肽没有明显的相似性。后来陆续从家蚕基因组中鉴定得到 11 个其他的 moricin 突变体(Cheng et al., 2006; Xia et al., 2004)。目前已经陆续从其他的昆虫中如斜纹夜蛾(Spodoptera litura) (Oizumi et al., 2005)、烟角天蛾(Manduca sexta) (Zhu et al., 2003)、moricin 类似物从斜纹夜蛾(S.litura) (Oizumiet al., 2005)和大腊螟(Galleria mellonella) (Brown et al., 2008)中分离获得moricin类似物。目前，对于鳞翅目特有的抗菌肽，研究比较少。对于这类抗菌肽作用于微生物的杀菌机制以及表达系统研究也不多。 众所周知，昆虫是世界上种类及数量最多的动物，但天然抗菌肽的来源仍然相当有限，只有通过化学合成及基因工程技术才能获得大量抗菌肽。化学合成抗菌肽价格昂贵，成本较高，因此基因工程技术是获得抗菌肽的首选方法，也是研究抗菌肽最热门的手段，但是moricin羧基末端几个氨基会形成特殊结构，很难通过化学合成法获得此抗菌肽。而且，moricin对宿主本身具有很强的毒性，在宿主菌中直接表达抗菌肽基因，有可能杀死宿主细胞而无法获得表达产物。出芽短梗霉属短梗霉属,是人和动物中的一种条件致病性真菌,可引起眼部疾病，如角膜炎、结膜炎等。它是一类类酵母真菌，与酵母关系密切，具有酵母样和真菌菌丝体两种形态。菌落最初粘稠，污白色，很快转变为淡绿色，最终为黑色。菌落质地由粘稠状到坚硬和革状，菌落边缘呈明显的根状。无性繁殖方式多样，主要类似于酵母菌的多边芽殖形式到形成明显的真菌丝。该霉菌还容易在油漆涂料上滋生，对其有较大的腐蚀作用和特殊的破坏力。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种小菜蛾moricin基因。本专利技术另一目的在于提供一种小菜蛾moricin蛋白。本专利技术另一目的在于提供一种小菜蛾moricin成熟肽蛋白的制备方法。本专利技术另一目的在于提供一种小菜蛾moricin和其成熟肽的应用。本专利技术的目的通过下述技术方案予以实现: 一种小菜蛾抗菌肽moricin基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1~2所示。其中SEQID N0:1为小菜蛾抗菌肽moricin基因的全基因序列(包括5’端非编码区、3’端非编码区和编码区序列)；SEQ ID NO:2为小采蛾抗囷妝moricin基因的ORF序列；0RF序列能编码65个氨基酸的蛋白。一种小菜蛾抗菌肽moricin,其氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。SEQ ID N0:3为小菜蛾抗菌肽moricin编码蛋白序列，该序列由65个氨基酸组成。一种小菜蛾抗菌肽moricin的成熟肽，成熟肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示；成熟肽对应的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示。一对扩增小菜蛾抗菌肽moricin的引物，引物的核苷酸序列如SEQ ID N0:11~12所示。一种重组表达载体，由出发载体的多克隆位点插入如上SEQ ID NO:1~2所述小菜蛾抗菌肽moricin的核苷酸序列或如上SEQ ID NO:5所述小菜蛾抗菌肽moricin的成熟肽的核苷酸序列。优选地,所述重组表达载体为pMTA-PxMor。一种重组细胞系，是由如上所述的重组表达载体转化受体细胞构建而成的，优选地，所述受体细胞为果蝇细胞系S2。一种小菜蛾抗菌肽moricin的成熟肽的制备方法，具体方法为向如上所述的重组细胞系中加入终浓度为250 mM的硫酸铜，连续收集10天诱导24小时后培养基上清，将收集的培养基上清混合在一起，离心，收集上清，除去细胞碎片，首先用平衡buffer平衡Ant1-V5凝胶珠，其次与收集的上清进行充分的温育，然后将Ant1-V5凝胶珠混合液加入柱子中，流速为0.05 ml/min，将所有收集的无细胞培养基通过柱子流过几次后，用平衡buffer洗脱柱子,直到收集的流出液测定蛋白浓度A280接近零时,用洗脱buffer洗脱蛋白，并预先在收集蛋白的管中加入100 mil M Tris-base, pH 8.0收集流出液，并将收集的组分用15% SDS-PAGE电泳分析蛋白的纯度和浓度，最后将收集的蛋白进行脱盐，利用超纯水对脱盐柱Excellulose GF_5进行平衡，然后将收集的蛋白加入到柱子中去，收集流出的蛋白，即为成熟肽。如上所述小菜蛾抗菌肽moricin的应用，用于制备抑制或杀死出芽短梗霉菌的制剂。如上所述小菜蛾抗菌肽moricin的成熟肽的应用，用于制备抑制或杀死出芽短梗霉菌的制剂。为了大量表达和快速纯化moricin，并且保持有活力的抗菌肽。本专利利用真核表达系统来表达了鳞翅目特有的抗菌肽moricin，通过阳离子交换纯化的方法获得具有活力的小肽，为应用生产奠定基础。为了筛选出对出芽短梗霉有活力的抗菌肽，我们做了大量的筛选工作，结果发现成熟肽moricin对出芽短梗霉有很强的抑制作用，显示出潜在的应用价值。为了在现实生活中控制出芽短梗霉对人类造成危害，本专利技术结合本实验室的优势，利用生物技术手段生产了成熟肽moricin蛋白，并将蛋白对本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种小菜蛾抗菌肽moricin基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO：1～2所示。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：金丰良，许小霞，李鹏，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：