本发明专利技术提供了一种鱼源抗冻多肽及其制备方法，以鱼皮胶原蛋白为原料，通过木瓜蛋白酶酶解，再经过分离纯化得到纯化的特异性抗冻多肽，氨基酸全序列为：Lys-Gly-Glu-Ala-Gly-Asp-Asn-Gly-Ala-Lys-Gly-Asp-Ala-Gly-Ser-Pro-Gly。本发明专利技术突破了国内外现存的抗冻蛋白的研究思路和方法，克服从天然生物体中纯化抗冻蛋白数量的局限性以及国际FDA组织对转基因抗冻蛋白在食品应用中的安全性顾虑，获得基于食品源的高效抗冻多肽，为开发基于食品源的抗冻多肽以及探索其在食品、医学上的广泛应用奠定理论基础。
【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术提供了，以鱼皮胶原蛋白为原料，通过木瓜蛋白酶酶解，再经过分离纯化得到纯化的特异性抗冻多肽，氨基酸全序列为：Lys-Gly-Glu-Ala-Gly-Asp-Asn-Gly-Ala-Lys-Gly-Asp-Ala-Gly-Ser-Pro-Gly。本专利技术突破了国内外现存的抗冻蛋白的研究思路和方法，克服从天然生物体中纯化抗冻蛋白数量的局限性以及国际FDA组织对转基因抗冻蛋白在食品应用中的安全性顾虑，获得基于食品源的高效抗冻多肽，为开发基于食品源的抗冻多肽以及探索其在食品、医学上的广泛应用奠定理论基础。【专利说明】
本专利技术涉及一种抗冻多肽，更具体地涉及了，属于生物
。
技术介绍
食品和医药产品在低温储存和运输过程中由于环境温度的波动变化而反复地遭受冰晶生长和重结晶的问题越来越受到人们的关注。温度的反复升降使冰晶不断生长、冻融和重结晶，严重破坏细胞和组织结构而失去产品应有的品质。世界范围内的科学家正面临严肃的挑战：如何控制冰晶生长及重结晶，实现低温冷链上的冰晶生长控制，是制约众多食品和医药广品品质的关键所在。抗冻蛋白，也称“冰结构蛋白”，是一类附着在冰晶体表面而抑制冰晶的生长和重结晶的活性蛋白质。抗冻蛋白由于其具有控制冰晶生长、减少细胞损伤及保持产品原有组织结构、质地和品质的特点和突出意义而成为热点研究主题。同样的研究还表明，抗冻蛋白的抗冻活性片断只存在于局部的特异多肽链结构域而并不是整体蛋白质在起作用，即使是纯化了的抗冻蛋白，抗冻活性往往不高，仍然需要探究其活性域来进一步提高抗冻效率。所以，如何获得食品源的结构紧凑的高活性抗冻多肽，就成为抗冻蛋白迫切的研究方向。
技术实现思路
为了解决上述问题，本专利技术提供了一种利用木瓜蛋白酶酶解鱼源胶原蛋白制备的抗冻多肽，使抗冻活性得以高 效地实现。本专利技术的一种抗冻多肽，是由17个氨基酸所构成的多肽。所述多肽的氨基酸序列为：Lys-Gly-Glu-Ala-Gly-Asp-Asn-Gly-Ala-Lys-Gly-Asp-Ala-Gly-Ser-Pro-Glyο本专利技术提供的抗冻多肽的制备方法：以鱼皮、鱼鳞的鱼源胶原蛋白为原料，对其进行酶解，将酶解产物进行分离纯化得到所述抗冻多肽。本专利技术进一步提供一种所述抗冻多肽的制备方法的酶解条件为：木瓜蛋白酶：鱼源胶原蛋白=1:10-15 (w/w)，pH为7.0、温度是35°〇_40°C、酶解时间为20-40分钟。其中优选的方案为：木瓜蛋白酶：鱼源胶原蛋白=1:10 (w/w)，pH为7.0、温度是37°〇、酶解时间为30分钟。本专利技术还提供所述的抗冻多肽的制备方法的分离纯化的步骤为：酶解产物首先利用Sephadex G-50凝胶色谱进行分离,洗脱液为去离子水,流速为2mL/min,洗脱峰在225nm下进行测量；收集具有最佳抗冻活性的峰，再用Sulfopropyl-Sepadex C-25阳离子交换色谱进行分离，洗脱液为NaCl浓度梯度为0-0. 5 M的0.01mol/L pH7. O的磷酸缓冲液，流速为O. 5mL/min ;收集具有最佳抗冻活性的峰，利用RP-HPLC-C18反相高效液相色谱再进行进一步的分离，反相HPLC的分离条件是用10%-90% (v/v)乙腈溶液作为洗脱液梯度洗脱，流速为lmL/min,收集25%乙腈和75 %水(>八）处的洗脱峰，得到所述抗冻多肽。为了实现上述方案，本专利技术采取的具体步骤如下： (I)明胶酶解条件的优化 本技术所采用的酶和鱼(鱼皮、鱼鳞）胶原蛋白购自Sigma生物试剂公司（中国?上海，酶活600u/mg)。采用单因素实验，分别对三个酶解因素进行考察，分别为酶解温度35°C、37°C、40°C、45°C和50°C，酶解时间10、20、30、40和60分钟以及酶-鱼源胶原蛋白配比1:100、1:50、1:20、1:15和1:10 w/w。称取I. 65克鱼源胶原蛋白溶解于6ml Mili-Q水中，然后用2mol/L NaOH将其pH调节至7. O。先将该溶液水浴加热到需要温度，接着再按不同的酶-底物配比加入相应量的酶，按照预定的反应时间开始反应。接着再在沸水浴中灭酶10分钟，冷却后再1000rpm离心10分钟。上清液收集后，分别对其抗冻活性进行测定，以确定最佳酶解条件。得到具有最大抗冻活性的酶解液的酶解条件是：PH为7. O、温度是37°C、酶解时间为30分钟、酶-底物配比为1:10。(2)酶解产物的分离、纯化 先在最佳酶解条件下进行酶解，得到的酶解产物先经过Sephadex G-50凝胶色谱(长100cm,直径2. 6cm)进行分离,洗脱液为去离子水,流速为2mL/min,洗脱峰在225nm下进行测量。收集具有最佳抗冻活性的峰，再用Sulfopropyl-Sepadex C-25阳离子交换色谱(长55cm,直径2. Ocm)进行分离,洗脱液为NaCl浓度梯度为0-0. 5 M的0.01mol/L pH7. O的磷酸缓冲液，流速为O. 5mL/min。收集具有最佳抗冻活性的峰，利用RP-HPLC反相高效液相色谱再进行进一步的分离，反相HPLC的分离条件是用10-90%乙腈溶液作为洗脱液，流速为lmL/min，得到高纯度的特异性抗冻多肽。(3)抗冻活性的测试 本专利技术按照国际抗冻蛋白活性检测的标准，建立抗冻活性检测系统。抗冻活性采用检测抗冻多肽对低温冻融细菌的保护作`用来测试。(4)氨基酸序列测定 利用蛋白质测序仪（Applied Biosystems Model 476A, Perkin Elmer Co. MA,U. S. A)测定特异性抗冻多肽的氨基酸全序列为：Lys-Gly-Glu-Ala-Gly-Asp-Asn-Gly-Ala-Lys-Gly-Asp-Ala-Gly-Ser-Pro-Glyο本专利技术立足于抗冻蛋白的抗冻活性片断只存在于特异的肽链结构域而不是整体蛋白质在起作用的理论基础，以来自于鱼源胶原蛋白为原材料，着眼于通过木瓜蛋白酶的切割条件控制，切割为具有特定的肽链长度和结构域组成的活性多肽，而使抗冻活性得以高效地实现。本专利技术为开发基于食品源的抗冻多肽以及探索其在食品、医学上的广泛应用奠定理论基础。【专利附图】【附图说明】图I纯化鱼皮胶原蛋白抗冻多肽的CLC-HPLC-C18色谱图； 图2纯化的特异性抗冻多肽对保加利亚乳酸杆菌的低温保护作用；其中，图中的A、B分别表示未添加特异性抗冻多肽样品的保加利亚乳酸杆菌、添加O. 5% (w/w)特异性抗冻多肽样品的保加利亚乳酸杆菌生长情况图。【具体实施方式】本专利技术的抗冻多肽是由17个氨基酸所构成的多肽。所述多肽的氨基酸全序列为：Lys-Gly-Glu-Ala-Gly-Asp-Asn-Gly-Ala-Lys-Gly-Asp-Ala-Gly-Ser-Pro-Glyο制备方法如下： 以鱼源胶原蛋白为原料，使用木瓜蛋白酶对其进行酶解，并按照国际抗冻蛋白活性检测的标准，建立抗冻活性检测系统，优化其酶解条件，得到具有最大抗冻活性的酶解液的酶解条件是：酶解PH为7. O、温度是37°C、酶解时间为30分钟、酶-底物配比为1:10 ;在最佳酶解条件下进行酶解，得到的酶解产物先经过S印hadex G-5本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种抗冻多肽，其特征在于：所述多肽的氨基酸序列为：Lys?Gly?Glu?Ala?Gly?Asp?Asn?Gly?Ala?Lys?Gly?Asp?Ala?Gly?Ser?Pro?Gly。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：汪少芸，蔡茜茜，王文龙，饶平凡，
申请(专利权)人：福州大学，
类型：发明
国别省市：
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