本发明专利技术属于植物源成分的检测技术，具体地说是用实时荧光PCR技术检测食品调味品中罂粟成分的检测方法。方法包括PCR扩增反应液和上游引物CODM?F：5’-GCTAAACTCACGCTTGCAGAAA-3’；下游引物CODM?R：5’-GTTACAGACGCACCAATATTATTCAAC-3。食品调味品中罂粟成分的检测方法包括产品DNA的提取、罂粟特异性基因的实时荧光PCR扩增和使用荧光定量PCR仪随机软件分析扩增结果并进行结果判定。其优点是快速、特异性强、灵敏度高、操作简便、成本低。
【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术属于植物源成分的检测技术，具体地说是用实时荧光PCR技术检测。方法包括PCR扩增反应液和上游引物CODM?F：5’-GCTAAACTCACGCTTGCAGAAA-3’；下游引物CODM?R：5’-GTTACAGACGCACCAATATTATTCAAC-3。包括产品DNA的提取、罂粟特异性基因的实时荧光PCR扩增和使用荧光定量PCR仪随机软件分析扩增结果并进行结果判定。其优点是快速、特异性强、灵敏度高、操作简便、成本低。【专利说明】
本专利技术属于植物源成分的检测技术，具体地说是用实时荧光PCR技术检测。
技术介绍
磐粟(Papaver somniferumL)是S粟科的二年生草本植物。原产小亚细亚、印度和伊朗。我国部分地区药物种植场有少量栽培。S粟壳含少量吗啡(Morphine)、可待因(Codeine)、蒂巴因(Thebaine)、那可汀(Narcotine)、S粟壳碱(Narcotoline)和S粟碱(Papaverine);另含多糖约 2.4水解可得乳糖10%、阿拉伯糖6%、木糖6%、鼠李糖4%、乳糖醒酸(Galacturonic acid) 60% >4-0-甲基葡萄糖醒酸(4-0-Methylglucuronic acid)4%、微量岩藻糖(Fucose)、2_0_ 甲基岩藻糖(2-0-MethyIfucose) >2-0-甲基木糖(2-0-Methylxylose)及葡萄糖醒酸(G-tucuronic acid)、景天庚糖(Sedoheptulose)、D-甘露庚酮糖(D-Mannoheptulose)、D-甘油基-D-甘露辛丽糖(D-Glycero-D-Mannooctulose)、内消旋肌醇(Mesoinositol)、赤藓醇(Erythritol)。食品中加入罂粟味道鲜美，但过量食用后易致瘾。本专利技术经过对罂粟和常见食品成分进行PCR检测验证，适合检验检疫对罂粟成分鉴定，引物对罂粟具有满意的特异性和灵敏性，具操作简单，成本低的特点。
技术实现思路
本专利技术属于植物源`成分的检测技术，具体地说是用实时荧光PCR技术检测食品调味品中罂粟成分检测方法，为检测罂粟成分提供有效工具，从而加强对食品安全问题的监督监管，保护消费者的合法权益。本专利技术的主要原理为:针对保守序列设计一组引物(上游引物:CODM F:5，-gctaaactcacgcttgcagaaa-3?和下游弓丨物:C0DM R:5，-gttacagacgcaccaatattattcaac-3’)。进行核酸检测时，模板DNA经加热至94-95°C—定时间后，DNA双链解离，即变性成单链。当温度下降到退火温度时，两条单链重新配对，即复性。PCR扩增的产物，变性状态下呈单链，荧光染料不与其结合就没有荧光信号。当温度为退火温度时，PCR产物复性成为双链DNA，荧光染料与其结合，可以检测到强的荧光信号。在双链DNA最多时，荧光信号最高，SP出现吸收峰，也就是在退火温度下出现最高的吸收峰。本专利技术涉及的，其中的试剂包括如下:(I) PCR扩增反应液A包括IXPCR Master Mix(内含热启动的Taq DNA聚合酶、氯化镁、dNTP)，400nmol/L上下游引物，1.25 μ L SYBR Green荧光染料；上游引物CODM F:5，-gctaaactcacgcttgcagaaa-3?;下游引物 CODM R:5，-gttacagacgcaccaatattattcaac-3，其中上游引物、下游引物:1: I ；其中dNTP内的四种脱氧核糖核酸的混合物的质量比为dTTP: dATP: dGTP: dCTP = 1:1:1:1。(2)阳性对照DNA上面所述PCR扩增反应液A，每管24μ L的最佳组成为:1XPCR MasterMix (内含热启动的Taq DNA聚合酶、氯化镁、dNTP)，400nmol/L上下游引物，1.25 μ L SYBR Green荧光染料。使用上述试剂盒检测食品调味品中罂粟成分的方法，依次包括下列步骤(1)-(3):(I)待检样品DNA的提取DNA提取可使用CTAB法。(2)食品调味品中罂粟成分的实时荧光PCR扩增A.在装有24 μ L PCR扩增反应液A的反应管中加入I μ L待检样品DNA，混匀。B.将PCR反应管放入荧光PCR仪，按下述反应条件完成PCR扩增:95°C 15min, I个循环预变性；950C 15sec,60°C lmin，40 个循环。(3)应用荧光定量PC R仪随机软件，测定熔点曲线。【具体实施方式】下面结合实施例对本专利技术做进一步说明。实施例1按下述方法检测从中药店购得的罂粟壳，使用玉米粉作为实验的阴性对照:包括IXPCR Master Mix(内含热启动的Taq DNA聚合酶、氯化镁、dNTP)，400nmol/L上下游引物，1.25 μ L SYBR Green荧光染料；上游引物CODM F:5，-gctaaactcacgcttgcagaaa-S，；下游引物 CODM R:5，-gttacagacgcaccaatattattcaac-3夕按照以下程序进行检测:(I)待测样品DNA的提取A.称取经过预处理的待测样本1.0Og至50mL离心管中；半固体样品和液体样品称取2.00~4.00至50mL离心管中。B.加入10mL65°C预热的CTAB提取缓冲液和RNase A酶(使其终浓度为10 μ g/mL),颠倒混匀后于65°C温育30min,期间颠倒混匀离心管2~3次；12000g离心IOmin,转移ImL上清液至2mL离心管中。C.在离心管中加入与上清液等体积的三氯甲烷中，上下颠倒充分混匀，12000g离心IOmin,转移上清液600 μ L至2mL离心管中。D.加入2倍体积CTAB沉淀液，颠倒混匀后，室温静置Ih ；12000g离心lOmin，弃去上清液。E.向沉淀中加入400 μ L氯化钠溶液，使之沉淀溶解，之后转移溶液至1.5mL离心管。F.在溶解液中加入等体积三氯甲烷，颠倒混匀后，12000g离心lOmin，转移上层水相至1.5mL离心管中。G.加入0.6倍体积经4°C预冷的异丙醇，颠倒混匀后，于4°C下静置30min ；12000g离心lOmin,小心弃去上清液。H.加入500yL70%乙醇，震荡离心柱管，12000g离心lOmin，弃去上清液，重复一次，在室温下挥干液体。1.加入100 μ L TE溶液溶解DNA，4°C保存备用。(2)待测样品DNA的实时荧光PCR扩增A.在PCR反应管中加入24 μ L PCR反应液A和I μ L样品DNA，混匀。 B.将PCR反应管放入荧光定量PCR仪，按下述反应条件完成PCR扩增:95°C 15min, I个循环预变性；950C 15sec,60°C lmin，40 个循环。(3)应用荧光定量PCR仪随机软件，测定熔点曲线。实施例2按下述方法检测从超市购得的罂粟与火锅调料的人工添加样品:包括IXPCR Mast er Mix(内含热启动的Taq DNA聚合酶、氯化镁、dNTP)，400nmol/L上下游引物，1.25 μ L SYBR Green荧光染料；上游引物CODM F:5，-gctaaa本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种食品调味品中罂粟成分检测的方法，其特征在于罂粟特异性引物：上游引物CODM?F：5’?GCTAAACTCACGCTTGCAGAAA?3’；下游引物CODM?R：5’?GTTACAGACGCACCAATATTATTCAAC?3’。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：高宏伟，孙敏，林超，刘彩霞，
申请(专利权)人：山东出入境检验检疫局检验检疫技术中心，
类型：发明
国别省市：
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