一种临床级神经干细胞系的建立方法及用途技术

本发明专利技术属于细胞生物学、神经生物学领域，提供一种临床级神经干细胞系的建立方法及其用途，该方法在GMP控制下，包括神经干细胞原代培养和神经干细胞传代培养两个步骤，通过该方法建立的神经干细胞系，经鉴定说明，能表达多种干细胞标志物，可以分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞，具有非常好的稳定性，适宜于长期培养，可获得大量足够的临床级神经干细胞，本方法不仅可以从多个神经干细胞，更可以从单个神经干细胞建立神经干细胞系，尽可能减少研究误差。采用本发明专利技术方法建立的神经干细胞系及其分化所得的细胞，能够有效解决对神经系统疾病进行细胞治疗中存在的安全性和有效性风险，使得安全有效治疗这些疾病成为可能。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术属于细胞生物学、神经生物学领域，提供一种临床级神经干细胞系的建立方法及其用途，该方法在GMP控制下，包括神经干细胞原代培养和神经干细胞传代培养两个步骤，通过该方法建立的神经干细胞系，经鉴定说明，能表达多种干细胞标志物，可以分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞，具有非常好的稳定性，适宜于长期培养，可获得大量足够的临床级神经干细胞，本方法不仅可以从多个神经干细胞，更可以从单个神经干细胞建立神经干细胞系，尽可能减少研究误差。采用本专利技术方法建立的神经干细胞系及其分化所得的细胞，能够有效解决对神经系统疾病进行细胞治疗中存在的安全性和有效性风险，使得安全有效治疗这些疾病成为可能。【专利说明】—种临床级神经干细胞系的建立方法及用途
本专利技术属于细胞生物学、神经生物学领域，特别是涉及一种神经干细胞系的建立方法及用途。
技术介绍
中枢神经系统损伤曾被认为不可修复，传统的药物等治疗方法也以维持现有神经细胞存活和功能为主。近年来，随着干细胞技术的研究和发展，研究人员发现神经系统损伤疾病发生时损伤丢失的神经细胞可以通过移植干细胞来恢复，且这种方法十分有效。神经干细胞(neural stem cells,NSCs)是一种具有自我更新能力和多向分化潜能的细胞，由于NSCs来源于神经系统，是天生的成神经细胞，神经干细胞移植治疗神经系统损伤疾病是最理想的选择。NSCs在体内外均能分化为各种神经细胞，移植到裸鼠体内不致瘤。临床上已有将神经干细胞应用于多种人神经系统损伤疾病治疗并取得很好疗效的报道。但是，由于NSCs常来源于引产的胚胎组织，通常的体外培养方法仅能对NSCs进行短期培养，一个胚胎组织最终能获得的细胞数量有限，如果要进行大规模的临床治疗研究，通常需要获得多个胚胎组织样本，如此存在较大的伦理学争议风险，同时不同样本来源的细胞其生物学性状存在差异，由此导致的结果也存在一定的变异性，因而影响了科学数据的准确性。因此，如果可以建立临床级NSCs细胞系，理论上可从一个胚胎样本中获得无限的可供临床治疗研究的NSCs，且这些NSCs生物学性状维持不变，可以有效避免采用非建系神经干细胞进行临床治疗研究产生的问题。另外，由于神经干细胞的单克隆形成能力低下，通常方法很难由一个神经干细胞培养成为神经干细胞球，而多个神经干细胞培养后形成的细胞球由于来源于多个细胞，细胞起始的不均一性更大，如此为之后的基础或临床研究增加难度。建立稳定的神经干 细胞建系有助于我们进一步进行NSCs移植治疗神经系统疾病的相关研究，但目前报道的神经干细胞建系的建立均基于转基因技术，即将永生化相关的基因如端粒酶基因或原癌基因稳定转染NSCs从而获得可以长期培养的NSCs，转基因技术可能会改变NSCs的部分生物学性状，甚至产生致瘤性，给研究带来风险与变数。因此，建立非转基因的NSCs细胞系有助于获得NSCs治疗神经系统疾病的准确研究结果。
技术实现思路
鉴于以上缺陷，本专利技术的主要目的在于提供。为了达到以上目的，本专利技术提供的该种临床级神经干细胞系的建立方法，在GMP控制下，包括神经干细胞原代培养和神经干细胞传代培养两个步骤，其中，所述神经干细胞传代培养具体再包括以下步骤:I).半量换液及收集神经干细胞条件培养基:当神经干细胞原代培养的半数神经球直径超过150 μ m时，竖立细胞培养瓶2分钟，使神经干细胞球沉降至瓶底，离心管吸出半量培养基之后，加入等量的新鲜神经干细胞原代培养基，换液完毕后放回细胞培养箱继续培养，再将上述吸出的半量培养基收集到15ml的离心管中，1300转/分钟离心5分钟，收集上清即可获得神经干细胞条件培养基，保存4°C备用；2).预处理:在神经干细胞传代前一天，向新的细胞培养瓶中加入适量神经干细胞条件培养基，备用；3).当培养神经干细胞的半数神经球直径超过200 μ m时，将神经干细胞及培养基收集到50ml离心管中，1300转/分钟离心5分钟，收集上清即可获得神经干细胞条件培养基，保存4°C备用；再将神经干细胞球重悬于神经干细胞消化液中，置于37°C培养箱消化10分钟，待可见细胞球略微松散时，加入胰酶抑制剂终止消化，采用巴斯德吸管将细胞轻轻吹打分散；4).离心收集细胞，离心条件为1300转/分钟，5分钟；5).取出前一天采用神经干细胞条件培养基预处理的细胞培养瓶，吸弃其中的培养基;6).将神经干细胞传代培养基与神经干细胞条件培养基1:1混合，之后采用此混合培养基重悬消化后的神经干细胞，并按1: 3传代接种于预处理过的细胞培养瓶；7).将传代后的神经干细胞置于细胞培养箱中培养；8).换液:传代3-5天后，进行半量换液:竖立细胞培养瓶2分钟，使神经干细胞球沉降至瓶底，离心管吸出半量培养基之后，加入等量的新鲜神经干细胞传代培养基，换液完毕后放回细胞培养箱继续培养，再将上述吸出的半量培养基收集到15ml的离心管中，1300转/分钟离心5分钟，收集上清即可获得神经干细胞条件培养基，保存4°C备用；9).重复按步骤2)-8 )方法进行神经干细胞的传代并培养，建立稳定的神经干细胞系。更进一步的，所述神经干细胞原代培养可以通过步骤实现:a.在完全知情同意告知下，无菌条件下分离10-16周无发育障碍流产胎儿的海马、皮层或纹状体组织，置于无菌的离心管中，剪刀剪碎；b.加入神经干细胞消化液，消化10分钟，将细胞消化为单细胞悬液；c.将细胞悬液按1300转/分钟的离心速度离心5分钟以收集细胞，将细胞重悬于神经干细胞原代培养基中，使其密度为4-5 X 105/ml ；d.将细胞悬液接种于T25细胞培养瓶中，置于细胞培养箱培养。更进一步的，所述神经干细胞原代培养可以通过以下步骤实现:a).在完全知情同意告知下，无菌条件下分离10-16周无发育障碍流产胎儿的海马、皮层或纹状体组织，置于无菌的离心管中，剪刀剪碎；b).加入神经干细胞消化液，消化10分钟，将细胞消化为单细胞悬液；c).采用流式细胞分离或者棋盘滴定的方法，将单细胞悬液接种到96孔板，使得每个孔只含有I个细胞，采用神经干细胞原代培养基进行培养，此方法建立的神经干细胞系来源于单个细胞。更进一步的，所述神经干细胞原代培养基由由基础培养基、B27、表皮生长因子(EGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、白血病抑制因子(LIF)、转铁蛋白、孕酮、腐胺、硒酸钠、胰岛素、肝素组成，其中，所述B27为IX ;EGF浓度15-25ng/ml，bFGF浓度15-25ng/ml, LIF 浓度 7_13ng/ml,转铁蛋白浓度 50-150 μ g/ml,孕酮 10-30nmol/L,腐胺50-150 μ mol/L,硒酸钠 20_40nmol/L,胰岛素 10-49 μ g/ml,肝素 3-10 μ g/ml,所述基础培养基由DMEM、F12、HEPES和D-葡萄糖组成，其中，DMEM和F12比例为体积比(1-3): 1，HEPES浓度为10-20mmol/L，D-葡萄糖浓度为质量/体积比l_2g/100ml。更进一步的，所述神经干细胞传代培养基由基础培养基、EGF、bFGF、LIF、转铁蛋白、孕酮、腐胺、硒酸钠、胰岛素、肝素组成，其中，EGF浓度15-25ng/ml，bFGF浓度15-25ng/ml, L本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种临床级神经干细胞系的建立方法，在GMP控制下，包括神经干细胞原代培养和神经干细胞传代培养两个步骤，其特征在于，所述神经干细胞传代培养具体再包括以下步骤：1).半量换液及收集神经干细胞条件培养基：当神经干细胞原代培养的半数神经球直径超过150μm时，竖立细胞培养瓶2分钟，使神经干细胞球沉降至瓶底，离心管吸出半量培养基之后，加入等量的新鲜神经干细胞原代培养基，换液完毕后放回细胞培养箱继续培养，再将上述吸出的半量培养基收集到15ml的离心管中，1300转/分钟离心5分钟，收集上清即可获得神经干细胞条件培养基，保存4℃备用；2).预处理：在神经干细胞传代前一天，向新的细胞培养瓶中加入适量神经干细胞条件培养基，备用；3).当培养神经干细胞的半数神经球直径超过200μm时，将神经干细胞及培养基收集到50ml离心管中，1300转/分钟离心5分钟，收集上清即可获得神经干细胞条件培养基，保存4℃备用；再将神经干细胞球重悬于神经干细胞消化液中，置于37℃培养箱消化10分钟，待可见细胞球略微松散时，加入胰酶抑制剂终止消化，采用巴斯德吸管将细胞轻轻吹打分散；4).离心收集细胞，离心条件为1300转/分钟，5分钟；5).取出前一天采用神经干细胞条件培养基预处理的细胞培养瓶，吸弃其中的培养基；6).将神经干细胞传代培养基与神经干细胞条件培养基1∶1混合，之后采用此混合培养基重悬消化后的神经干细胞，并按1∶3传代接种于预处理过的细胞培养瓶；7).将传代后的神经干细胞置于细胞培养箱中培养；8).换液：传代3～5天后，进行半量换液：竖立细胞培养瓶2分钟，使神经干细胞球沉降至瓶底，离心管吸出半量培养基之后，加入等量的新鲜神经干细胞传代培养基，换液完毕后放回细胞培养箱继续培养，再将上述吸出的半量培养基收集到15ml的离心管中，1300转/分钟离心5分钟，收集上清即可获得神经干细胞条件培养基，保存4℃备用；9).重复按步骤2)?8)方法进行神经干细胞的传代并培养，建立稳定的神经干 细胞系。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：栾佐，
申请(专利权)人：栾佐，
类型：发明
国别省市：