一种微流芯片的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种微流芯片的制备方法，包括如下操作：掩膜制备操作：设计两种掩膜，掩膜包括感光区和非感光区，其中，第一掩膜的感光区包括第一封闭图形及与第一封闭图形间隔一定距离的带状图形，第二掩膜的感光区包括在第一封闭图形的基础上平行扩大至与带状图形相连形成的第二封闭图形以及带状图形；另外还包括第一刻蚀操作和第二刻蚀操作以及键合操作。根据本发明专利技术方法得到的芯片能够有效分选肿瘤细胞，并且在捕获肿瘤细胞后对其进行直接分析。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术公开了，包括如下操作：掩膜制备操作：设计两种掩膜，掩膜包括感光区和非感光区，其中，第一掩膜的感光区包括第一封闭图形及与第一封闭图形间隔一定距离的带状图形，第二掩膜的感光区包括在第一封闭图形的基础上平行扩大至与带状图形相连形成的第二封闭图形以及带状图形；另外还包括第一刻蚀操作和第二刻蚀操作以及键合操作。根据本专利技术方法得到的芯片能够有效分选肿瘤细胞，并且在捕获肿瘤细胞后对其进行直接分析。【专利说明】
本专利技术涉及，尤其涉及一种用于捕获肿瘤细胞的微流芯片的制备方法。
技术介绍
循环肿瘤细胞通常是指来自于原发肿瘤组织，经脱落和浸染而进入人体外周血的细胞，在循环细胞转移过程中能够在不同的组织上寄居，并且可以在许多转移后的固相肿瘤上发现，因而循环肿瘤细胞可以作为早期肿瘤诊断的重要标志。另外循环肿瘤细胞在肿瘤的转移和复发中也起到重要作用。因此，对于循环肿瘤细胞生理机制的研究具有非常重要的意义。然而循环肿瘤细胞的数目及其在人体外周血中的绝对浓度非常低，使得针对循环肿瘤细胞的研究变得非常困难，因此对循环肿瘤细胞的分选和捕获是一个重要的研究课题。目前，常用的细胞分选技术是流式细胞术，但是该技术使用的设备昂贵、体积庞大、需要专业人员进行操作，而且细胞的用量较大，难以在实验室和医院普及推广。微流芯片技术具有微型化、集成化、自动化和细胞试剂用量少、污染风险低等优点。近期，在微流芯片中使用较多的肿瘤细胞捕获方法是利用针对某些肿瘤细胞中上皮细胞粘附分子(epithelial cell adhesion molecule,EpCAM)的特异性表达进行特异性分选。该方法先对基底材料进行特定的表面处理使之具有纳米结构，然后进行表面化学修饰将Ant1-EpCAM抗体偶联到基底上来捕获肿瘤细胞。但是EpCAM作为一种上皮细胞表面标记物，在不同类型的肿瘤细胞中的表达程度不同，其使用受到肿瘤细胞种类的限制。另外，对于基底的化学修饰步骤繁琐耗时，增加了不确定因素干扰试验的成功率。另外还有通过操控声表面波的驻波，利用声辐射力来直接操控肿瘤细胞进行分选和捕获；采用介电泳的方法，利用电介质粒子在不均匀电场中受力的不同对细胞进行分选和捕获，但是这些方法都不可避免的对细胞活性产生不良影响。另外，应用目前微流芯片的制备方法得到的芯片，在捕获肿瘤细胞后，缺乏在芯片上分析细胞的能力，需要转移至离心管后才能进行后续试验，该转移过程不易做到并且会造成大量细胞损失。
技术实现思路
为此，本专利技术提出了一种可以解决上述问题的或至少能部分解决上述问题的。根据本专利技术的一个方面，提供了 ，该方法包括如下操作:掩膜制备操作:设计两种掩膜，在胶片上制备相应的掩膜，所述掩膜包括感光区和非感光区，其中，第一掩膜的感光区包括第一封闭图形及与所述第一封闭图形间隔一定距离的带状图形，第二掩膜的感光区包括在所述第一封闭图形的基础上平行扩大至与所述带状图形相连形成的第二封闭图形以及所述带状图形；第一刻蚀操作:将第一掩膜置于玻璃铬板上进行第一次刻蚀，形成高度为15?25um的凹陷部和沟道；第二刻蚀操作:在玻璃铬板上放置第一掩膜的位置处放置第二掩膜后进行第二次刻蚀，形成高度为25?35um的凹陷部和沟道以及高度为15?25um的隔挡部，得到基片；键合操作:将所述基片与盖片进行键合。根据本专利技术的制备方法得到的微流芯片，由于形成的凹陷部作为捕获肿瘤细胞的区域，其中隔挡部顶端和基片以及隔挡部顶端与凹陷部的底部具有一定距离，形成一个相对的微台阶结构，这样将尺寸较大的肿瘤细胞(一般在25?35um)拦截在捕获区，而尺寸较小的血细胞(一般在15?25um)通过隔挡部上部以及沟道流出，因此可以在捕获区有效地分选到大部分的肿瘤细胞。该芯片操作简便，被捕获的细胞可保持良好的活性，透明地玻璃基底便于对捕获的细胞进行实时的原位观测。对于被捕获与固定在芯片中的肿瘤细胞可进行一系列的后续试验，如免疫荧光染色、荧光原位杂交等，应用该方法制备得到的芯片在与细胞相关的研究和临床领域中具有广阔的应用潜力。其中，在制备掩膜时主要是利用CorelDraw软件设计掩膜图形，采用高分辨率的激光照排机在胶片上制得掩膜。一般在第二刻蚀操作完成后，需要再次放入去铬液中对刻蚀完的玻璃铬板进行除铬，去除裸露的铬层。在键合操作中，是将刻蚀有微结构的玻璃基片与聚二甲基硅氧烷层经过氧等离子处理后使聚二甲基硅氧烷层与玻璃基片键合在一起。可选地，根据本专利技术的制备方法，其中在第一掩膜和第二掩膜中包括至少一个带状图形。根据本专利技术的制备方法，在第一掩膜和第二掩膜上的带状图形，在进行刻蚀后，形成沟道，当具有一条带状图形时，形成一个沟道，这样小分子细胞可以集中流出，当选择多条带状图形时，小分子细胞流出更加顺畅。可选地，根据本专利技术的制备方法，其中所述第一掩膜和所述第二掩膜进一步地包括环状封闭图形，所述环状封闭图形与所述带状图形连接。当掩膜中设计有带状图形连接的封闭图形时，进行刻蚀后，形成不同的沟道，带状图形形成的沟道中的流出的小分子可以流入封闭图形刻蚀形成的沟道中，这样更利于小分子细胞集中输送至出口，更有利于小分子细胞集中输出。可选地,根据本专利技术的制备方法，其中在第一掩膜的第一封闭图形及第二掩膜的第二封闭图形中均包括用于形成微柱的非感光单元。在第一掩膜和第二掩膜的封闭图形中设置非感光单元，刻蚀以后在凹陷部和隔挡部形成微柱阵列，形成的微柱阵列可以支撑盖板，保证隔挡部和盖板之间的距离，保证了小分子通过的通道距离，有效筛选小分子。可选地，根据本专利技术的制备方法，在第一刻蚀操作和第二刻蚀操作包括光刻步骤和腐蚀步骤。可选地，根据本专利技术的制备方法，在第一刻蚀操作的光刻步骤中，将铺设第一掩膜的玻璃铬板曝光9?IOs ；将曝光后的玻璃铬板在质量百分比为0.4?0.6%的NaOH水溶液中显影25?35s ；将显影后的玻璃铬板在100~120°C烘烤8~12分钟；将烘烤后的玻璃铬板在去铬液中浸泡40~60s。可选地，根据本专利技术的制备方法，其中在第二刻蚀步骤的光刻操作中，在第一次刻蚀的玻璃铬板上铺设AZ5214正光刻胶；将第二掩膜铺设在所述玻璃铬板上后曝光14~16s ；将曝光后的玻璃铬板在显影液中显影I~2分钟；将显影后的玻璃铬板在115~125°C烘烤8~12分钟；将烘干的玻璃铬板在去铬液中浸泡40~60s。在第二次刻蚀时，选用了 AZ5214正光刻胶，可以保证在腐蚀的过程中，使非感光区的铬层不被腐蚀掉。其中所述显影过程是在AZ5214显影液中进行的，其中AZ5214显影液的主要成份为2.38%的四甲基氢氧化铵。可选地，根据本专利技术的制备方法，其中所述去铬液是由25g硝酸铈铵、6.45mL浓度为70%的高氯酸溶于IlOmL蒸馏水中所配成。可选地，根据本专利技术的制备方法，其中，在第一刻蚀步骤的腐蚀步骤中，在腐蚀液中腐蚀15~25分钟；在第二刻蚀步骤的腐蚀步骤中，在腐蚀液中腐蚀8~13分钟；所述腐蚀液由体积比为1:0.5:0.5 的 Smoir1HF ^moir1NH4F ^moir1HNO3 溶液配成。根据本专利技术的方法，利用所述腐蚀液，其腐蚀速度可以控制在I U m/min,因此根据腐蚀速度，可以控制腐蚀时间以及腐蚀深度。可选地，根据本专利技术的制备方法，其中，所本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种微流芯片的制备方法，该方法包括如下操作：掩膜制备操作（S1100）：设计两种掩膜，在胶片上制备相应的掩膜，所述掩膜包括感光区和非感光区，其中，第一掩膜的感光区(100)包括第一封闭图形(101)及与所述第一封闭图形（101）间隔一定距离的带状图形(102)，第二掩膜的感光区(200)包括在所述第一封闭图形（101）的基础上平行扩大至与所述带状图形（102）相连形成的第二封闭图形(201)以及所述带状图形(102)；第一刻蚀操作（S1200）：将第一掩膜置于玻璃铬板上，对玻璃铬板进行第一次刻蚀，形成高度为15～25um的凹陷部和沟道；第二刻蚀操作（S1300）：在玻璃铬板上与第一掩膜位置重合处放置第二掩膜后对玻璃铬板进行第二次刻蚀，形成高度为25～35um的凹陷部和沟道以及高度为15～25um的隔挡部，得到基片；键合操作（S1400）：将所述基片与盖片进行键合。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：刘威，刘侃，张南刚，国世上，周鹏飞，
申请(专利权)人：武汉友芝友医疗科技有限公司，
类型：发明
国别省市：